豬尿中鹽酸賽庚啶殘留指示物研究

吳劍平， 張 鑫， 李丹妮， 嚴 鳳， 周悅榕， 顧 欣

（上海市獸藥飼料檢測所，上海長寧 201103）

鹽酸賽庚啶是一種H1受體拮抗藥，在臨床上主治皮膚瘙癢、蕁麻疹、濕疹、過敏性和接觸性皮炎、鼻炎、偏頭痛、支氣管哮喘等疾病（關保元等，2007；王雷等，2004）。鹽酸賽庚啶用于畜禽養殖業可以促進動物生長，其具有抗5-羥色胺的作用，可抑制下丘腦的飽覺中樞而刺激食欲，增加體重。賽庚啶在動物體內的殘留可對食用者的健康產生危害。

本試驗通過動物實驗，獲得了實際飼喂含鹽酸賽庚啶飼料的生豬尿液，并利用已建立的分析方法對其進行分析檢測，獲得豬尿中鹽酸賽庚啶原藥的殘留情況。動物體內鹽酸賽庚啶的主要代謝途徑為葡萄糖醛酸修飾和芳香基團修飾（Xesús等，2009），因此對尿液進行葡萄糖醛酸酶和硫酸芳基酯酶酶解后進行測定，并通過與尿中原型藥物殘留量的比較得到其主要代謝產物的殘留量情況，從而確定鹽酸賽庚啶在豬尿中的殘留指示物。

1 試驗材料

1.1 儀器 超高效液相色譜串聯質譜系統（Waters○RUPLC-TQ MS，Masslynx○R工作軟件）；高速冷凍離心機 （Allegra X-22R，BECKMAN COULTER）；AL204電子天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；減壓旋轉蒸發儀（B-490，BUCHI）。

1.2 材料、藥品與試劑 十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱（Agilent○R SB-C18，3.0 mm×100 mm，1.8 μm）；混合型離子交換SPE柱 （Waters○R MCX，60 mg 3cc）。鹽酸賽庚啶標準品（Sigma，Lot：068k1565，98%）；鹽酸二苯拉林標準品（Sigma，Lot：126 h3541，100%）；β-葡萄糖醛酸苷酶（Merk， 美國，85000 IU/mL）；芳基硫酸酯酶（Merk，美國，7500 IU/mL）。 高氯酸（分析純）；甲酸（色譜純）；乙腈（色譜純，Merk）；甲醇（色譜純，Merk）；氨水（分析純）；去離子水（自制，電阻率>10 MΩ·cm）；高純氮（上海佳杰特種氣體公司，99.999%）；高純氬（上海佳杰特種氣體公司，99.999%）。

2 實驗方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：十八烷基硅烷鍵合硅膠色譜柱；流動相A為0.1%甲酸；流動相B為0.1%甲酸-乙腈，優化色譜條件后的梯度程序見表1。柱溫為40℃；流速為0.3 mL/min；進樣量5 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 質譜條件 電離模式：正離子電噴霧電離（ESI＋）；質譜檢測模式：多反應監測（MRM）；毛細管電壓：3.0 kV；離子源溫度：150℃；脫溶劑氣流量：800 L/h；脫溶劑溫度：500℃；孔流速：50 L/h；碰撞氣（Ar）流速：0.25 mL/min。分析中以保留時間和離子對豐度比作為定性分析依據，經過實驗優化后的質譜參數見表2，典型MRM圖見圖1b。

表2 監測離子對質譜參數

2.3 樣品前處理 取5.00 g豬尿樣品，其中加入 50 μL含 100 μg/L鹽酸二苯拉林的標準工作溶液，用5%氨水調節pH至11.0，再以異丙醇為分散劑，三氯甲烷為萃取劑，在5 mL豬尿體系中加入2 mL三氯甲烷-異丙醇 （5∶3，V/V）混合提取液和0.75 g氯化鈉，渦旋振蕩5 min使其形成水－分散相－提取劑充分混勻的體系。靜置后，4℃下8000 r/min高速離心5 min，吸取下層溶劑至離心管中50℃氮氣吹干后，用1 mL 0.1%甲酸-乙腈（80∶20，V/V）溶解后過濾，上機測定，空白樣品和實際樣品典型MRM圖見圖1a和圖 1c。

圖1 鹽酸賽庚啶及鹽酸二苯拉林MRM圖

2.4 動物實驗 選取15頭100日齡健康生豬，分3組進行飼喂實驗，其中A組為空白對照組，B組為低劑量實驗組，C組為高劑量實驗組，飼喂飼料除添加藥物量不同外其他均相同，一天飼喂兩次，分欄飼養，具體飼喂量如表3所示，一天分早晚兩次進行尿液采集，當天將采集到的尿液進行3000 r/min高速離心，取上清液50 mL存于尿樣管中，4℃保存待測。

表3 實驗動物每頭份飼喂量

2.5 分組給藥實驗結果 按2.4動物實驗過程進行藥物添加飼喂，采集尿樣按2.1～2.3中檢測方法進行分析測定，結果如圖2所示。實驗結果表明，在飼料中添加不同含量的鹽酸賽庚啶對實驗動物進行飼喂后，其尿液中的鹽酸賽庚啶含量比空白對照組有顯著提高，且與飼料中的添加含量呈正相關。

圖2 分組給藥實驗結果

2.6 酶解反應條件優化 使用2.5實驗中所采集第3天B1豬的尿樣進行酶解條件優化，5 mL尿液中添加20 μL β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶，根據試劑說明書描述最優酶解pH=5.6，對反應溫度進行優化。分別在35、45、55、65℃條件下酶解 1、2、4、6、8 h 后對鹽酸賽庚啶含量進行測定，所得如圖3所示。結果表明，在35℃條件下需要反應的時間較長，8 h仍未達到反應終點；在45℃和55℃時需要4 h可達到反應終點，65℃下只需2 h，但55℃和65℃下達到終點后鹽酸賽庚啶含量有一定的下降趨勢，可能是由于溫度較高容易促使鹽酸賽庚啶原型藥物發生其他反應。因此，實驗結果表明最優酶解條件為5 mL尿液中添加20 μL β-葡萄糖醛酸苷酶/芳基硫酸酯酶，55 ℃下酶解4 h。

圖3 酶解溫度優化結果

2.7 非酶解和酶解后尿中鹽酸賽庚啶含量的比較 對2.5中分組飼喂實驗中所采集的尿樣進行酶解，比較酶解后與酶解前所測得的豬尿中的鹽酸賽庚啶含量，結果如圖4所示。實驗結果表明，豬尿中鹽酸賽庚啶原型藥物含量占主要代謝物種類中的絕大多數，可以作為豬尿中檢測鹽酸賽庚啶的殘留指示物。

圖4 非酶解和酶解結果比較

2.8 停止給藥消除實驗 在2.5分組給藥飼喂實驗結束后停止在B組和C組飼料中添加藥物，然后，連續7 d進行采樣，檢測豬尿中鹽酸賽庚啶殘留量，結果如圖5所示。實驗結果表明，停止給藥后豬尿中鹽酸賽庚啶原型藥物殘留量有明顯下降趨勢，其中半衰期為2 d，6 d后完全消失。

圖5 停藥消除實驗結果

3 結論

本實驗結果表明，豬尿中鹽酸賽庚啶主要以原型藥物的形式存在。其含量與飼喂量呈正相關，半衰期為2 d，6 d后幾乎完全消除。

[1]關保元，李建強，李淑云，等.鹽酸賽庚啶治療喘息性支氣管炎50例療效分析[J].中國冶金工業醫學雜志，2007，24（8）：504.

[2]王雷，梁穎，楊新建，等.鹽酸賽多平乳膏與鹽酸賽庚啶乳膏對照治療慢性神經性皮炎 75 例[J].中國新藥雜志，2004，13（10）：938 ～ 939.

[3]Xesús F，Lei Y，Seyed V H，et al.Development and validation of LC-MS/MS method for the determination of cyproheptadine in several pharmaceutical syrup formulations[J].Journal of Pharmaceutical and Biomedical Analysis，2009，50：1044 ～ 1049.■