康復新液對實驗性大鼠皮膚切割傷痂下愈合的影響

張 俊，孟令賀，單士軍，張理濤

（1.天津醫科大學研究生院，天津300070；2.天津市中醫藥研究院附屬醫院皮膚科，天津300120）

康復新液是美洲大蠊提取物制成的液體制劑，成分復雜，主要為多元醇類、氨基酸及肽類活性物質，能散淤活血、養陰生肌[1]。該藥在臨床上應用已久，既可內服用于消化道潰瘍等輔助治療，又可外用于金瘡、燒傷、燙傷、瘺管、褥瘡等創面。普遍認為該藥能改善創面微循環、加速組織修復、抗菌消炎和增強免疫力[2]。然而對損傷較大的痂下愈合傷口的研究報道較少。此外，由于成分復雜，其促進創面愈合的具體作用機制有待進一步闡明。因此，本研究建立大鼠痂下愈合的創傷愈合模型，通過對創面組織進行取材，觀察藥物作用不同時間后，痂下愈合組織的病理學及形態學改變，探討康復新液對切割傷痂下愈合傷口的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗材料

1.1.1 藥物與試劑 康復新液：四川好醫生攀西藥業有限責任公司生產，批號：110916。美寶濕潤燒傷膏：汕頭市美寶制藥有限公司生產，批號：111025。生理鹽水，水合氯醛，硫化鈉，酒精，二甲苯等購自天津生化試劑公司。

1.1.2 動物 清潔級Wistar大鼠，雌雄各半，體質量180～220 g，購自軍事醫學科學院衛生學環境醫學研究所，許可證號：SCX K－（軍）2009-003。

1.1.3 主要儀器設備 電子分析天平（上海天平儀器廠），光學顯微鏡（OLYMPUS，I×70日本），常規切片機，常規手術器械等。

1.2 實驗步驟

1.2.1 切割傷造模 Wistar大鼠，8%硫化鈉背部脫毛，溫水清洗后歸籠。術前一晚禁食水，手術當天10%水合氯醛（300mg/k g）腹腔注射麻醉，以大鼠背部脊柱為中線，設計一個左右對稱面積約2.5 cm×2.5 cm的正方形創面。75%酒精消毒后，按設計完整切除皮膚、淺筋膜，直至深筋膜淺面，徹底止血。傷后按40mL/kg體質量腹腔注射生理鹽水行休克期復蘇，術后傷口消毒，單籠喂養，自由飲水取食。

1.2.2 實驗分組及給藥 大鼠造模后隨機分為4組：A組為生理鹽水陰性對照組，B組為美寶陽性對照組，C組為康復新液高劑量組（原液組），D組為康復新液低劑量組（1/2原液組），每組12只。造模0.5 h后換藥，A、C、D組以注射器滴加的方式將藥物緩慢浸沒傷口，B組以醫用棉簽均勻涂抹覆蓋創面，每次換藥前以75%酒精徹底消毒，清除上次殘留藥物后進行。給藥后創口均保持自然暴露狀態，數分鐘后歸籠。各組每天早、晚各換藥1次。

1.2.3 觀察指標和檢測方法

1.2.3.1 透明膠片法計算創面愈合率：于造模成功后第 0、4、7、10、14 天用無菌透明膠片覆蓋皮膚，沿創口邊緣描繪損傷面積的圖形，剪下相應圖形，以分析天平稱取損傷創口面積的膠片重量，計算損傷皮膚面積的減少率。按下列公式計算：創面愈合面積百分率＝（用藥前膠片重量－用藥后膠片重量）/用藥前膠片重量×100%，并拍照存證。

1.2.3.2 創面組織病理學檢查：于手術第4、7、14天時間點上，各組均隨機抽取3只大鼠行組織病理檢查。10%水合氯醛腹腔注射麻醉，小心將創面全層皮膚取下，并處死大鼠。切取的組織以10%的甲醛溶液固定，石蠟包埋。常規切片，蘇木精—伊紅染色（HE染色），檢測用藥不同時間后創傷愈合組織內炎細胞浸潤，毛細血管生成，成纖維細胞增生及表皮增生，膠原形成等組織病理學改變。

1.3 統計學方法 實驗結果的計量資料用x±s表示，采用SPSS18.0統計軟件進行分析處理，用單因素方差分析（one－way ANOVA），并用 q檢驗（Student-Newman-Keuls法）對數據進行兩兩比較，當P<0.05時認為差異有統計學意義，當P<0.01時為差異非常顯著。

2 結果

2.1 康復新液對大鼠創傷愈合過程的影響 見圖1。各組大鼠在造模與給藥過程中無一例死亡，無明顯感染現象，精神狀態和活躍程度較佳。造模成功后即刻觀察，可見各組創傷處約2.5 cm×2.5 cm大小皮膚全層缺失，直至深筋膜，創面濕潤，創口有少許血液和漿液滲出。造模第4天，各組傷口滲出物干燥形成薄層痂皮，覆蓋創面，創口均明顯縮小，創緣收縮。陰性組創口周圍腫脹，邊緣有少許滲液。陽性組和康復新液組創口腫脹輕微，創緣分泌物少，痂皮表面干燥、呈暗紅色，觸之較軟。造模第7天，陰性組表面有滲出物，創緣收縮不明顯。陽性組創面部分痂皮脫落，可見其下方肉芽組織生長旺盛，觸之易出血。康復新液組部分大鼠創面痂皮局部脫落，殘留痂皮表面干燥、皺縮、呈暗紅色，觸之質韌，邊緣不規整。造模第14天，陰性組尚有部分陳舊痂皮未脫落，其余部分為肉芽組織填充，創面濕潤柔軟，收縮明顯。陽性組和康復新液組創面陳舊痂皮完全脫落，創面收縮與再上皮化顯著，肉芽組織生長活躍，呈鮮紅色。創傷愈合期間，康復新液高、低劑量組促進創面愈合作用的差異性不明顯。

圖1 陰性對照組、陽性對照組、康復新液高劑量組W istar大鼠切割傷愈合情況Fig 1 Thewound healing situation of thenegative,positiveand Kangfuxin liquid high-dosegroup

2.2 切割傷創面愈合率 見表1，圖2。統計學分析顯示，在各時間點，康復新液高、低劑量組創面愈合百分率均明顯高于陰性組，差異有統計學意義（P均<0.01），而與陽性組相比，差異無統計學意義（P均>0.05）。康復新液高劑量組創面愈合百分率高于低劑量組，但差異無統計學意義（P均>0.05）。

表1 各組創傷大鼠不同時間點創面愈合百分率Tab1 The healing rate of different groupsat different time points(x±s,%)

表1 各組創傷大鼠不同時間點創面愈合百分率Tab1 The healing rate of different groupsat different time points(x±s,%)

與陰性對照組相比*P＜0.01；與陽性對照組相比#P>0.05

組別 n 創面愈合百分率4 d 7 d 10 d 14 d陰性對照組 6 4.69±1.63 12.36±3.25 41.13±4.77 65.98±4.50陽性對照組 6 14.04±2.15*23.17±2.84*52.85±4.65*75.82±2.32*康復新高劑量組 6 14.37±2.32*#26.57±3.77*#57.41±3.99*#77.76±1.74*#康復新低劑量組 6 12.68±2.33*#24.10±2.71*#51.43±3.10*#73.68±3.62*#

圖2 各組不同時間點大鼠皮膚創傷愈合百分率比較Fig 2 The comparison of skin wound healing rate in each group at different time points

2.3 HE染色結果 見圖3。術后第4天，各組創面皮膚表皮缺失，薄層血痂形成，其下有少量肉芽組織形成。陽性對照、康復新液高、低劑量組可見成纖維細胞及新生毛細血管管腔較陰性對照組豐富，而巨噬細胞、中性粒細胞、淋巴細胞的浸潤相對陰性對照組略少。術后第7天，各組創面陳舊痂皮下肉芽組織生成。陽性對照、康復新液高、低劑量組肉芽組織豐富，可見大量成纖維細胞，伴有膠原纖維形成，新生毛細血管多，其周圍浸潤的炎性細胞減少。其中陽性對照組和康復新液高劑量組表皮層已開始形成，其上仍覆血痂。而陰性對照組炎細胞與成纖維細胞浸潤明顯，膠原纖維形成少，間質較疏松。術后第14天，各組創面已基本形成皮膚分層結構。陽性對照、康復新液高、低劑量組新生細胞已形成明顯的表皮細胞層，增生顯著，下方可看見典型毛囊結構，結締組織中成纖維細胞少而膠原纖維多，排列較整齊；陰性組仍有炎細胞浸潤，尚可見大量成纖維細胞，膠原纖維相對較少且排列紊亂。

圖3 不同時間點各組創面組織HE染色圖(×40)Fig 3 The HE staining figuresof thenegative,positiveand Kangfuxin high-dosegroup(×40)

3 討論

美洲大蠊作為藥用最初見于《神農本草經》，用于治血痰癥、破積聚等。康復新液是美洲大蠊蟲體提取物，已應用于臨床多年，最初用于燒傷、燙傷、戰傷等，后逐步用于消化道潰瘍、宮頸疾病、皮膚黏膜損傷及癌癥的治療[3-4]。多年臨床應用提示該藥能加快多種創口愈合，然而近年有研究發現，對于某些特殊類型的傷口，康復新液換藥時間過長，反而影響治療效果[5]。痂下愈合多見于皮膚損傷，其創傷表面形成褐色硬痂，愈合在痂下進行，愈合所需時間長。痂皮對傷口有保護作用的同時不利于外用藥物滲透，臨床干預措施較局限。本實驗發現康復新液具有較強的滲透性，對大鼠皮膚大面積切割傷痂下愈合亦有明顯促進作用。在創傷愈合早期能促進成纖維細胞、新生毛細血管的生長，同時能抑制創面炎細胞浸潤；創傷愈合中后期能促進肉芽組織成熟、膠原形成及表皮增生，加快陳舊血痂脫落，起到促進皮膚切割傷愈合的作用。其作用機制可能是在創傷愈合不同階段，通過作用于多個靶點發揮作用。

細胞外基質(extracellularmatrixc,ECM)是創傷修復過程中的關鍵，主要成分有膠原蛋白、彈力蛋白、纖維連接蛋白、層黏連蛋白、基質細胞蛋白和蛋白多糖等。細胞受到刺激后釋放的多種生長因子同樣發揮了重要作用，如表皮生長因子、轉化生長因子、成纖維細胞生長因子、血管內皮細胞生長因子、白介素1及血小板釋放的血小板源性生長因子等。成纖維細胞是創面愈合中的主要修復細胞，本研究發現康復新液組創傷初期組織的成纖維細胞數量較陰性組多，提示該藥可能有促進成纖維細胞增殖或遷移的作用，推測與其含有表皮生長因子等成分有關。宋芹等[6]曾通過細胞劃痕實驗，初步探明美洲大蠊提取物對體外培養皮膚成纖維細胞有促進其向創面遷移的作用，這或許是其促進創面愈合的機制之一。李珊瑚等[7]認為該藥促進創傷愈合根本在于其原料中的W11-a12,可能是多環節地影響了生長因子、成纖維細胞及IV型膠原、纖維結合蛋白、表皮細胞、微量元素,還有ECM及多種細胞因子，從而促進創面修復。此外，康復新液能有效增強創面的牽張強度，提示該藥能增加創面內膠原的產生與沉積，促進創面組織重建[8]，這與我們通過組織學檢查所得結果相符。一項動物實驗證實，本品能阻止慢性胃潰瘍病理瘢痕的形成，可能與抑制生長激素、羥脯氨酸的合成表達，優化成纖維細胞功能有關[9]。此外，葉本蘭等[10]發現該藥可在一定程度上抑制放射損傷引起的鈣依賴性鉀通道開放增加，這也可能是其促進創面愈合的一個重要途徑。

康復新液對常見創面的修復有著獨到的促進作用，臨床實踐中已得到證實。但是由于其成分復雜且多變，真正的活性物質基礎不夠明確[11]，創傷愈合過程中涉及多個環節、多種因子，故目前針對其促愈機制的研究還是比較淺顯，對具體的作用過程了解不夠詳細,尤其是在細胞和分子水平的研究還比較少。深入研究康復新液對創傷愈合過程中關鍵酶、生長因子和細胞因子表達的影響，將會進一步揭示其促進創傷愈合的作用機制。

[1]焦春香,劉光明,周萍.天然藥物康復新的研究進展[J].時珍國醫國藥,2008,19(11):2623

[2]鄒金凱,傅得興.康復新液的臨床應用[J].首都醫藥,2008,8(4):29

[3]陳筱云.康復新液治療褥瘡60例的臨床觀察[J].中國實用醫藥,2013,8(7):158

[4]高黎黎,王魯平,李光輝.康復新的臨床新用途[J].中國誤診學雜志,2006,6(7):1390

[5]劉碧霞,李玉云,陶佳.康復新液不同用藥時間在兒童耳前瘺管換藥中的療效觀察[J].浙江中醫藥大學學報,2013,37(1):94

[6]宋芹,張臻,毛茜,等.美洲大蠊提取物對小鼠真皮成纖維細胞遷移影響的初步研究[J].中藥與臨床,2013,4(1):34

[7]李珊瑚,李勇敏,彭淑珍.康復新液對家兔創傷愈合的影響[J].臨床和實驗醫學雜志,2006,5(6):730

[8]舒崇湘,程天民.康復新對單純皮膚創面和合并全身放射損傷時的促愈作用[J].第三軍醫大學學報,1999,21(3):16

[9]蘇金仁,陳瑾,黃秀深,等.康復新液對大鼠胃潰瘍病理瘢痕形成的影響[J].中藥材,2013,36(6):979

[10]葉本蘭,舒崇湘,程天民,等.電離輻射對3T3細胞膜鈣依賴性鉀通道的影響及康復新的作用[J].中國應用生理學雜志,2002,18(3):83

[11]王光強,陳鑒東,徐小軍,等.固相萃取高效液相色譜法測定康復新液中有效成分KFX-4[J].亞太傳統醫藥,2012,8(12):24