納米銀的制備及其對變異鏈球菌抗菌性的研究

李長娥，于丹妮，韓育植，李 娜

（天津醫科大學第二醫院口腔科，天津300211）

變異鏈球菌（Streptococcusmutans,簡稱變鏈菌）是公認的致齲菌，氟化物是有效的防齲劑，近幾年隨著其廣泛高濃度的應用，變鏈菌耐氟株不斷出現[1]，這使氟化物防齲效果降低。但齲病的患病率仍然較高，故臨床上需要開發新型有效的防齲藥物。納米銀是一種新型非抗生素類抗菌劑，目前尚無細菌對其耐藥，具有量子效應、小尺寸效應和較大的比表面積等特性，呈現出獨特的、優于普通材料的生物相容性及抗菌性等性能。納米銀的制備方法有多種，主要分為物理法、化學法和生物還原法，其中液相化學還原法因操作方便、設備簡單等特點而成為最常用的方法。國內外有對納米銀的制備及其抗菌性等方面的報道[2-3]，但在葡萄糖制備的納米銀對口腔細菌抗菌性的研究還相對較少。本研究采用室溫下葡萄糖還原硝酸銀的液相化學還原法制備納米銀，并測定了該納米銀對變鏈菌標準株及耐氟株的抑菌圈直徑、最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration,MIC）、最小殺菌濃度（minimum bactericidal concentration，MBC）的大小，初步探討了其對實驗菌的抗菌性，為新型防齲藥物的研制提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實驗菌株 變異鏈球菌Ingbritt C（血清C型）國際標準株（以下稱標準株）購自四川大學口腔醫學研究所；變異鏈球菌耐氟株（以下稱耐氟株）本課題組成功構建并保存[4]。

1.1.2 主要試劑 TPY 培養基（OXOID，英國）；硝酸銀、葡萄糖、聚乙烯吡咯烷酮（PVP）、氫氧化鈉（NaOH）、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）等均為分析純（天津化學試劑有限公司）。

1.1.3 主要儀器設備 磁力攪拌器（DF－…，上海）；高速離心機（Sigma，美國）；微量加樣器（Eppendorf，德國）；紫外分光光度計（BECKMAN，美國）；標準96孔微量板（Costor，美國）。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌懸液的制備 從-70℃冰箱中將變鏈菌標準株及耐氟株取出，常規復蘇，分別接種于TPY固體培養基，37 ℃厭氧（80%N2，10%H2，10%CO2）培養48 h，經涂片和生化鑒定為純菌后，分別挑取單個菌落轉種于TPY液體培養基，過夜培養后4 000 r/min離心10 min，棄上清，用生理鹽水將細菌沉淀物調節為0.5麥氏濁度（即1.5×108CFU/mL）的菌懸液備用。

1.2.2 納米銀的制備 a液：將0.51 g硝酸銀溶解于10mL蒸餾水中；b液：將1.08 g葡萄糖、0.75 g PVP、0.192 g NaOH、1.02 g CTAB放入燒瓶中，加入30mL蒸餾水，攪拌使其完全溶解。室溫下，將a液迅速加到b液中，溶液立即變為紅棕色，即納米銀溶膠（簡稱溶膠）生成，繼續攪拌30min。將該溶膠12 000 r/min離心10min，棄上清，并用蒸餾水進行震蕩沖洗，如此重復3次。然后高溫烘干得到納米銀粉末，經預實驗證實該納米銀在較低濃度下抗菌性較好，用蒸餾水配制800μg/mL的溶膠作為實驗藥品，置暗處4℃下存放。用紫外-可見分光光度法（ultr aviolet-visible，UV-vis）、X 線 衍 射 （X －ray diffraction，XRD）、透射電子顯微鏡（transmission electronmicroscopy，TEM）對該納米銀進行表征。

1.2.3 抑菌環實驗 將直徑為10mm的標準定性濾紙片高壓滅菌后，保存備用。在超凈臺內，用無菌棉棒蘸取稀釋為106CFU/mL的菌液，均勻涂抹在TPY平板上，分別制備兩菌平板，置室溫干燥5 min。分別將30μL納米銀溶膠（800μg/mL）、蒸餾水滴到兩濾紙片（即1號、2號）上為實驗、對照紙片，一式2份，并晾干、紫外照射30min。在兩菌平板上，分別放上兩種紙片。將平板倒置、放于37℃恒溫箱厭氧培養24 h。觀察結果，并測量抑菌環直徑，測3次取平均值，實驗重復3次。

1.2.4 MIC、MBC的測定 將800μg/mL的溶膠用TPY 液體培養基二倍稀成 400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.12、1.56、0.78μg/mL 的系列濃度。取兩塊96孔板，在每一板內分別向第一行的1到10孔內依次加入100μL上述銀溶膠。然后吸取100μL稀釋為106CFU/mL的兩菌液分別加到兩板的以上各孔內并混勻。11號孔為陽性對照僅加入200μL菌液，12號孔為陰性對照加入800μg/mL的溶膠200μL。一式3份，實驗重復3次。密封孔板，置于37℃溫箱厭氧培養24 h，觀察各孔的混濁度。在96孔板中，當陽性對照呈現混濁（有菌生長），陰性對照澄清（無菌生長）時，實驗組中未見混濁孔的最低納米銀濃度即為該溶膠對實驗菌的MIC。MBC值的測定：從未混濁的實驗孔里分別取100μL液體，滴到TPY固體培養基上，涂布均勻，37℃溫箱厭氧生長24 h，板中未見菌生長或菌落數小于5個的藥液最低濃度視為MBC值。實驗重復3次，取平均值。

1.3 統計學處理 納米銀對標準株及耐氟株的抑菌圈直徑、MIC、MBC值分別以x±s表示，采用SPSS 20.0統計包軟件進行方差分析。

2 結果

2.1 納米銀的表征 室溫下，葡萄糖還原硝酸銀制備出的納米銀為：均一、粒徑小、分散性高、多結晶的類球形銀粒子。如圖1，納米銀的UV-vis圖顯示銀粒子最大等離子吸收峰在411 nm處，單峰、左右對稱、半峰寬較窄（在300～500 nm內）。將納米銀溶膠置于暗處4℃下，存放1個月，穩定性較好；如圖2，納米銀的XRD圖中出現表征銀的4個明顯峰值，對應的晶面指數由里到外依次為（111）、（200）、（220）、（311），即該納米銀為較高純度的銀納米粒子，且為多晶結構；如圖3，TEM圖表明納米銀為分散性較好、均粒徑約為13.04 nm的類球形粒子。

圖1 納米銀的UV-vis圖Fig 1 UV-visspectrum of silver nanoparticles

圖2 納米銀的XRD圖Fig 2 XRD of silver nanoparticles

圖3 納米銀的TEM圖Fig 3 TEM of silver nanoparticles

2.2 抑菌環結果 納米銀溶膠對標準株及耐氟株的抑菌環清晰效果較好（圖4），抑菌環直徑分別為（10.87±0.67）mm、（9.68±0.86）mm,對照組無顯著抑菌性，抑菌環直徑為（0.25±0.12）mm，（0.26±0.11）mm。經方差分析可知：與對照組相比，納米銀溶膠對標準株、耐氟株有較高的抑菌效果，差異有統計學意義（P<0.05）；但溶膠對標準株、耐氟株的抑菌性無統計學差異（P>0.05）。

圖4 納米銀溶膠對標準株及耐氟株的抑菌圈圖Fig 4 Thezonesof inhibition of silver colloidsagainst two strains

2.3 MIC、MBC值 納米銀溶膠對標準株及耐氟株的 MIC 分別為（2.08±0.90）μg/mL、（2.60±0.90）μg/mL，MBC 分別為 （4.16±1.81）μg/mL、（5.21±1.81）μg/mL。溶膠對標準株、耐氟株有較高的抑菌殺菌效果，差異有統計學意義（P<0.05）；但溶膠對標準株、耐氟株的抗菌性無統計學差異（P>0.05）。

與對照組相比，葡萄糖制備的納米銀對標準株及耐氟株均有抗菌性，差異有統計學意義（P<0.05）；對標準株的抑菌環直徑大于耐氟株，MIC、MBC值低于耐氟株，但對兩菌的抗菌效果無統計學差異（P>0.05）。

3 討論

變鏈菌是最重要的致齲菌，它在唾液中的正常量約為1×105CFU/mL[5]，實驗中將菌液濃度調為105～106CFU/mL，接近人體口腔中正常的變鏈菌量，使實驗結果有指導意義。氟化物有公認的防齲效果，但隨著氟化物大量廣泛的應用，耐氟株（可降低氟化物的抑菌性）不斷出現。因此，臨床上需要研發新型有效的防齲藥物，同時還應避免耐藥株的出現。納米銀是以納米技術為基礎研制出的一種新型非抗生素類抗菌劑，不易產生耐藥性，且廣譜高效、安全性高，有傳統無機抗菌劑無法比擬的作用效果。液相化學還原法是制備納米銀最常用的方法，它是在液相有保護劑存在下，將銀鹽中的銀離子還原成銀原子，制備出納米銀粒子的方法。納米銀粒子的粒徑與其抗菌性有關，粒徑越小則抗菌性越高[6]，通過合成方法和反應條件可對其進行調控。最近，有納米銀抑制牙釉質表面變鏈菌粘附性的研究[7]，也表明小粒徑納米銀有較高的抗菌性。

本研究中還原劑葡萄糖，綠色、價廉、易得；保護劑PVP，可阻止所形成的銀粒子發生團聚，且在一定程度上可起到還原銀離子的作用；反應在室溫下進行。通過UV-vis分光光度、XRD及TEM 3種最常用的表征手段[8-9]，對納米銀的結構和性能進行了表征：制備的納米銀為分散均勻、均粒徑約為13.04 nm類球形的顆粒。UV-vis圖可表征納米銀粒子的形貌，球形表現為單峰，半峰寬越窄則粒徑分布越均勻。XRD是鑒定物質晶相的有效手段，XRD圖中出現代表銀粒子的4個明顯峰值，說明納米銀晶體有4個晶面，對應的晶面指數從里向外依次為（111）、（200）、（220）、（311），即該納米銀為多晶結構。TEM可以研究納米銀的結晶情況，觀察納米粒子的形貌、分散情況，測量和評估粒子的粒徑，能準確、直觀地測出納米銀的形態（如球形等形狀）等。

金屬銀和銀離子有較好的抗菌性。銀離子的抗菌性主要是借靜電吸引力與帶負電的細菌結合來實現的[10]：它可干擾肽聚糖的合成、破壞細胞壁，損傷細胞的功能系統，與細菌蛋白質、DNA反應而抑制細胞的生長與繁殖，從而達到抑菌殺菌的效果。另外，細菌死亡后銀離子可從細胞內游離出來，可重復殺菌。但是納米銀的抗菌機制目前尚未完全清楚，它是一種細菌細胞內、外同時作用的復雜機制。納米銀的抗菌性與表面接觸相關，能抑制呼吸鏈的酶系統及改變DNA的合成等[11]。它可抑制微生物的生長，穿過細菌細胞壁破壞細胞膜，進而與細胞內物質結合，且不同類型細菌的細胞壁差異較大，抑菌效果不同：納米銀對革蘭陽性菌的抗菌性低于革蘭陰性菌的[12]。納米銀可在細胞壁上產生小孔，進入周質空間，破壞細胞膜結構使其滲透性發生變化；進入細胞內部，使DNA濃縮，并與破損細菌的細胞質結合積聚，最終引起胞內物質流失使細菌死亡[13]。此外，納米銀在液體環境中容易釋放銀離子，這將使其抗菌性進一步增強。

隨著納米技術的不斷發展，納米狀態下銀的殺菌能力得到提高，少量的納米銀即可產生較強的殺菌效果。Juan等[11]研究表明納米銀對變鏈菌的抗菌性（MIC 為 4.86μg/mL±2.71μg/mL，MBC 為 6.25 μg/mL）高于納米金、氧化鋅。本研究中，納米銀對兩實驗菌均有較高的抗菌性，差異有統計學意義（P<0.05）。抑菌環直徑、MIC、MBC是表征藥物抗菌性最常用的指標：同等條件下，抑菌環直徑越大，MIC、MBC值越小，藥物的抗菌性越高。標準株和耐氟株均為革蘭陽性菌對溶膠的敏感性相似，溶膠對兩菌株的抗菌性無統計學差異（P>0.05）。該納米銀表現出較高抗實驗菌的性能，少量、低濃度的納米銀溶膠可產生較好的抗菌效果。在臨床應用中可以避免牙齒著色，符合低毒美觀的要求，是用于抑制變鏈菌較理想的防齲藥物。同時，含納米銀與季銨鹽的抗菌劑對牙本質上的變鏈菌也有較好的抗菌效果，將來可以溶于牙科粘結劑、密封劑及復合材料等達到抗菌作用[14]。此外，納米銀與多種抗生素可產生協同殺菌作用[15]，能增強原藥物的殺菌效果，可用于耐藥菌的防治。

本實驗中，室溫下葡萄糖還原硝酸銀可制備出均一、分散性好、均粒徑約為13.04 nm的類球形納米銀粒子，抗菌性能測試表明該納米銀對變鏈菌標準株及耐氟株均有較高的抗菌效果，在防齲、口腔抗菌材料領域有廣闊的應用前景。今后尚需對納米銀的制備方法、抗菌機制及在口腔環境和臨床轉化實驗等方面做進一步研究，為齲病的防治提供一定的實驗依據。

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