白藜蘆醇對淋巴瘤BJAB細胞體外增殖及細胞周期作用的研究

何廣輝，孫豐源

（1.天津市眼科醫院玻璃體視網膜中心，天津醫科大學眼科臨床學院，天津300040；2.天津市第一中心醫院眼科，天津 300192）

白藜蘆醇(resveratrol，Res)于1940年首次從毛葉藜蘆的根部提取獲得，它廣泛存在于虎杖、葡萄等21個科、31個屬的72種植物中[1]，是一種天然活性成份。從19世紀70年代至今，大量科學實驗證實白藜蘆醇具有抗腫瘤活性，對腫瘤的起始、促進、發展3個主要階段均有抑制作用[2-4]。本實驗選取B淋巴細胞來源的BJAB細胞作為實驗對象，應用四甲基偶氮唑鹽微量酶反應比色法（MTT法）比較不同作用濃度及作用時間的Res對BJAB細胞增殖的影響，并應用流式細胞術（Flow cytometry，FCM）分析Res對BJAB細胞周期的影響，為其作為抗B細胞淋巴瘤藥物的應用提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 材料 BJAB細胞由天津醫科大學免疫學教研室楊潔教授惠贈。Res由南開大學醫學院惠贈。MTT、青霉素、鏈霉素、碘化丙啶購自Sigma公司。RPMI-1640干粉、PBS干粉、二甲基亞砜購自GIBCO公司。

實驗儀器：CO2培養箱（SANYO），倒置相差顯微鏡（NIKON），超凈工作臺（蘇州凈化設備公司）,Milli-Q超純水系統，恒溫烤箱（格蘭仕），酶標測定儀（BIO-RAD），臺式低速離心機（北京醫用離心機廠），低溫冰箱（SANYO），低溫高速離心機（HITACHI），分析天平（BOSCH），24孔及 96孔培養板（Cellstar），細胞培養瓶（GLOSTAR），流式細胞儀（COWTER）。

1.2 方法

1.2.1 實驗分組及給藥 實驗分為空白對照組和實驗組。空白對照組加入不含Res、無血清的RPMI-1640培養液；實驗組分為6組，分別加入含終濃度為5、10、25、50、75、100μg/mL的Res，每組設6個復孔。

1.2.2 MTT法檢測Res對BJAB細胞增殖的影響

BJAB細胞以103/孔接種于96孔板中，加入含10%胎牛血清的RPMI-1640培養液200μL培養48h,然后換為無血清無雙抗的培養液200μL繼續培養24 h，實驗組分別加入含不同濃度Res的培養液200μL，空白組加無血清的培養液200μL，分別作用24、48、72 h，觀察細胞形態的變化。實驗及空白組常溫低速離心（800 r/min）5min后吸出上清液100μL，然后加入20μLMTT液，37℃,5%CO2培養箱繼續孵育4 h后，加入150μLDMSO，室溫下于微量振蕩器上振蕩5min，于570 nm測定各孔OD值。計算不同濃度藥物對細胞的抑制率（IR）。IR%=（對照組OD值-實驗組OD值）/對照組OD值×100%[7]。

1.2.3 FCM檢測Res對BJAB細胞周期的影響

細胞培養及加藥過程同前，分別收集實驗組25、50、100μg/mLRes作用 24 h和 50μg/mLRes作用24、48、72 h的BJAB細胞以及對照組BJAB細胞，每份加冷PBS洗滌離心2次，然后加預冷的70%乙醇4℃固定過夜。次日棄去乙醇后，PBS洗滌離心，棄去上清液，每份樣本加0.2mLPBS，將細胞輕輕吹打成單細胞懸液，加入0.5mLPI染液，40℃避光染色30min，488 nm檢測熒光強度，計算各時相細胞比例及增殖指數[PI=（S＋G2）/（G1＋S＋G2）][8-9]。

1.3 統計學方法 采用SPSS11.5統計軟件，所有數據用x±s表示，經正態分布和方差齊性檢驗，進行組間單因素方差分析。樣本率之間的統計分析用χ2檢驗。

2 結果

2.1 形態學改變 不同濃度藥物作用后，實驗組與對照組相比，細胞密度有所下降，細胞形態發生變化，部分細胞體積縮小，呈小圓形，部分細胞呈梭形，核仁不清晰，胞質不勻，隨著濃度的增加，細胞數目減少，并且多數細胞呈梭形。隨著藥物作用時間延長，實驗組細胞密度降低，細胞不同程度呈現出核固縮、核碎裂、核溶解等凋亡特征（圖1～3）。

圖1 25μg/m L Res作用24 h后BJAB細胞形態學改變（×200）Fig 1 M orphology changeof BJAB cellaffe cted by 25 μg/m L Res for 24 h（×200）

圖2 50μg/m L Res作用24 h后BJAB細胞形態學改變(×200）Fig 2 M orphology changeof BJAB cell affected by 50μg/m L Res for 24 h

圖3 50μg/m L Res作用48 h后BJAB細胞形態學改變（×200）Fig 3 M orphology changeof BJAB cell affected by 50μg/m L Res for 48 h

2.2 MTT法測定Res對BJAB細胞的抑制作用見表1。

表1 不同濃度藥物組作用不同時間后的OD值（x±s，n=6）Tab1 OD value of different durations and densities of Res on BJAB（x±s，n=6）

不同濃度的Res作用于BJAB細胞24、48、72 h，均可不同程度地抑制細胞的增殖。其中5μg/mLRes與對照組比較，在24 h作用不明顯，而其余各濃度組在各時間點與對照組比較，對細胞都有明顯的抑制作用（P<0.05或P<0.01）。結果可見，Res對BJAB細胞的抑制作用呈時間依賴性和劑量依賴性（圖4）

圖4 不同濃度Res對BJAB作用不同時間的抑制率Fig 4 Inhibition ratio of different durationsand densitiesof Reseffected on BJAB

2.3 流式細胞儀檢測Res對BJAB細胞周期的影響 以濃度為 0、25、50、100μg/mL處理細胞 24 h后，用流式細胞儀檢測BJAB細胞周期，結果見表2。可見隨著Res濃度增大，G1期細胞百分數增多，而S、G2期的細胞數量逐漸減少，計算增殖指數可見，隨著用藥濃度增大而BJAB細胞增殖指數呈下降趨勢（P＜0.05）。

表2 不同濃度Res作用24 h對BJAB細胞周期的影響Tab2 Influence of cell cycle of BJAB which affected by different densitiesof Res for 24 h

用 50μg/mL Res分別處理 BJAB細胞 0、24、48、72 h，流式細胞儀檢測結果顯示隨著Res作用時間延長，G1期細胞百分數增多，而S、G2期的細胞百分比逐漸減少（表3）。

表3 50μg/m L Res在不同作用時間對BJAB細胞周期的影響Tab3 Influence of cell cycle of BJAB which affected by different durationsof 50μg/m L Res

3 討論

Res化學名 3，5，4-三羥基芪 (3，5，4-trihydroxystilbene），是一種植物防御素（phytoalexin），具有廣泛的生物學活性，如抗腫瘤、抗動脈粥樣硬化、抗凝血、抗氧化、抗菌、免疫調節及神經保護等[10-11]。近年來研究發現Res在抗腫瘤方面具有較好的效果，其抗腫瘤作用機制主要體現在以下各方面：（1）防止正常細胞癌變[12-13]：抑制細胞色素P450 1A1（CYP 1 A1）；抑制環氧酶(COX)；抗氧化損傷。（2）抑制腫瘤細胞增殖[14-15]：抑制DNA復制過程的關鍵酶；拮抗雌激素；改變自分泌生長調節因子；抑制腫瘤細胞自分泌活性氧。（3）促進腫瘤細胞凋亡[16-17]：作用于細胞周期蛋白及細胞周期蛋白依賴性激酶而致凋亡；通過p53引發凋亡；影響bcl-2家族誘導凋亡；通過線粒體介導凋亡。本實驗研究發現，高濃度及長時間Res作用可使BJAB細胞形態發生改變，胞體變為梭形，兩極尖細，胞質渾濁，核固縮，甚至消失，胞間增寬，細胞碎片增多。5μg/mLRes在短時間內對BJAB細胞增殖抑制作用不明顯，當時間延長至48 h，可顯著抑制BJAB細胞的增殖（P<0.05），而25、50、75、100μg/mL 組在各時間點與對照組比較，對細胞都有明顯地抑制作用（P<0.01）。同一濃度的藥物隨著作用時間的延長，抑制作用逐漸加強，表明Res對BJAB細胞的抑制作用呈時間依賴性。而同一時間內，隨著藥物濃度的增加，抑制作用也增強，表明Res對細胞增殖的抑制作用具有劑量依賴性。

Jazirehi等[18]認為，Res可以抑制非霍奇金淋巴瘤以及多發性骨髓瘤細胞的增生，并促進其凋亡，原因在于Res可以使腫瘤細胞的細胞周期停留在G1期，此外，Res還可以選擇性地下調抗凋亡蛋白Bcl-xL和骨髓細胞分化因子1（Mcl-1），并可以上調凋亡前體蛋白Bax和凋亡蛋白酶激活因子Apaf-1。本實驗研究發現用不同濃度的Res處理細胞24 h后，用FCM檢測BJAB細胞周期，可發現隨著Res濃度增大BJAB細胞G1期細胞百分數增多，而S、G2期的細胞逐漸減少，并且隨著用藥濃度增大而BJAB細胞增殖指數呈下降趨勢。用50μg/mLRes分別處理BJAB細胞0、24、48、72 h，流式細胞儀檢測結果顯示隨著Res作用時間延長BJAB細胞G1期細胞百分數增多，而S、G2期細胞逐漸減少。

Res對BJAB細胞的作用可能涉及多種機制，本實驗證實Res直接抑制BJAB細胞增殖，并導致其產生細胞周期的改變。本實驗僅在細胞水平上觀察了Res對BJAB細胞的作用，有待進一步在分子及蛋白質水平研究其作用機制，并且需要進行動物實驗來證實Res針對淋巴瘤動物模型治療的有效性和安全性，將這一相對經濟、有效、低副作用的植物活性成分應用于淋巴瘤患者的臨床治療。

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