黃芩中7種單體成分對金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌的體外抑菌活性研究

李秀玲 ，方步武

（1.天津醫科大學研究生院，天津300070；2.天津市南開醫院藥劑科，天津300100；3.天津醫科大學藥理學教研室，天津 300070）

肺炎是一種常見疾病，根據病原菌分類包括細菌性肺炎、病毒性肺炎、支原體肺炎等。其中細菌性肺炎占成人各類病原體肺炎的80%。肺炎鏈球菌是引起肺炎、中耳炎、敗血癥和腦膜炎的常見病原菌，青霉素等β-內酰胺類抗生素在很長一段時間內一直是治療該菌感染的首選而有效的藥物。但是由于大量和不恰當使用抗菌藥物，肺炎鏈球菌逐漸產生了耐藥性，特別是對青霉素及大環內酯類抗菌藥物的耐藥性倍受國際上的關注。由于中草藥具有副作用小、不易殘留和較少出現耐藥性等優點，使得從中草藥中篩選抗菌藥物越來越受到國內外學者的廣泛重視[1]。黃芩是中醫治療肺炎的臨床常用中藥，具有較廣的抗菌譜[2]，尤其對細菌性肺炎具有良好的療效[3]。黃芩為唇形科植物黃芩Scutellaria baicalensis Georgi的干燥根，具有清熱燥濕、瀉火解毒、止血、安胎的功效。黃芩藥材主產于河北、山西、內蒙古和東北等地，藥用成分主要為黃酮類化合物，其中含量較高的成分有黃芩苷、漢黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、千層紙素等[4]。黃芩的主要抗菌成分為黃芩苷，以往都使用黃芩藥材或者黃芩苷粗品進行體外抗菌實驗[5-7]，本文除了選用黃芩苷以外，還選取了黃芩中含量較高的6種特征成分，并且均使用其標準品(確保了成分的單一性)，觀察7種單體對易引起細菌性肺炎的致病菌金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌的敏感性,為黃芩的抗菌活性以及其它有效成分的開發利用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株來源 肺炎鏈球菌標準株31001（中國藥品生物制品檢定所提供）；金黃色葡萄球菌（哈爾濱醫科大學提供）。

1.1.2 黃芩7種單體 黃芩苷、黃芩素、漢黃芩素、白楊素（批號依次為 110715-201016、111595-200905、111514-200403、111701-200501，中國藥品生物制品鑒定所）；漢黃芩苷（上海融禾醫藥科技有限公司）；野黃芩苷（批號110842-201106，中國食品藥品檢定研究院）；千層紙素（上海源葉生物科技有限公司）。

1.1.3 培養基 綿羊血（批號081008）；牛肉粉（批號20080808，北京奧博星生物技術有限責任公司）；瓊脂；蛋白胨。

1.1.4 主要儀器 生物安全柜CLASS…TYPE B2（北京東聯哈爾儀器制造有限公司）；高速冷凍離心機KDC-160HR(科大創新股份有限公司中佳分公司)；振蕩培養箱HZQ-F160（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）；電熱恒溫培養箱DHP-9162（上海一恒科技有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 培養基的制備 （1）液體培養基：取燒杯加適量水，依次加入牛肉浸膏5 g，蛋白胨10 g，氯化鈉5 g，加蒸餾水至1 000 mL，用10%NaOH調節pH7.2～7.4，115℃高壓滅菌 20min，備用。（2）固體培養基：液體培養基加2%瓊脂，其余同（1）。（3）血清培養基：液體培養基中加5%～10%羊血，其余同（1）。

1.2.2 細菌培養 將真空凍干保存的肺炎鏈球菌標準株用少量液體培養基溶解后，直接接種于10%血瓊脂斜面培養基上，37℃培養24 h，挑取典型菌落傳代,將傳代后的菌落接種至10%綿羊血清肉湯培養基中，置于振蕩培養箱中，37℃，120 r/min，培養24 h。金黃色葡萄球菌直接傳代于瓊脂斜面培養基上，方法同上。

1.2.3 菌液的制備 將上述培養的帶菌液體培養基及血清肉湯培養基離心，3 000 r/min，15min，棄去上清液，收集細菌沉淀，用少量的生理鹽水溶解細菌沉淀，將此菌液做為原菌液，用無菌生理鹽水稀釋成 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7、10-8、10-9、10-10濃度，分別取上述濃度的菌液500μL，分別接種于固體培養基上，37℃培養24 h，選取菌落數在30～300個之間者計數，計算原菌液濃度，用生理鹽水將原菌液精確配成1×105CFU/mL～1×106CFU/mL濃度。

1.2.4 最低抑菌濃度（MIC）的測定 參考美國臨床實驗室標準化委員會（CLSI/NCCLS）介紹的方法—稀釋法測定。由于本實驗使用標準品量小，所以采用微量稀釋法。

參考以往文獻黃芩苷對金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌的最低抑菌濃度[5-7]設置初始濃度為2mg/mL。取黃芩苷、黃芩素、漢黃芩苷、漢黃芩素、野黃芩苷、白楊素、千層紙素標準品各1mg，用少量DMSO溶解后加入營養肉湯培養基配制成2mg/mL的溶液。向96孔板第1～12列每孔加入100μL，向1、2列分別對應加入上述所配置的溶液100μL，混合均勻后從第2列吸去100μL至第3列，如此連續倍比稀釋至第11列，取100μL棄去，使各孔濃度依次為原液濃度 的 1/2、1/4、1/8、1/16、1/32、1/64、1/128、1/256、1/512、1/1 024。向 2～12 列分別加入金黃色葡萄球菌液100μL。另取96孔板加入血清肉湯培養基以及肺炎鏈球菌，方法同上。搖勻37℃培養24 h,取出觀察細菌生長情況，以肉眼觀察無細菌生長為最低濃度。

2 結果

7種單體對金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌在96孔板中的細菌生長結果分別見表1、2。結果表明黃芩苷、黃芩素對兩種致病菌有不同程度的抑菌作用，黃芩素抑菌效果更好。

表1 7種不同濃度黃芩單體成分對金黃色葡萄球菌生長的抑制情況

表2 7種不同濃度黃芩單體成分對肺炎鏈球菌生長的抑制情況

由于肉眼觀察結果可能存在誤差，所以分別從每一孔取一環接種在相應的固體培養基中，37℃培養24 h再次觀察，以無細菌生長為最低抑菌濃度。結果見表3。漢黃芩苷、漢黃芩素、野黃芩苷、白楊素、千層紙素5種單體在2mg/mL對金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌無抑菌現象。

表3 7種不同黃芩單體成分對金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌的最低抑菌濃度（M IC，mg/m L）

3 討論

西醫治療肺炎通常使用抗生素，但是隨著抗生素的大量使用，細菌的耐藥現象日益嚴重，金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌也逐漸產生了耐藥性[8-9]。由于細菌耐藥率增高,所謂“難治性”肺炎屢見不鮮,尤其在兒童、老年人和免疫抑制患者中病死率較高，在抗生素藥物使用過程中，多重耐藥時有發生，為臨床治療感染帶來很多難題，耐藥菌感染已嚴重威脅我們的正常生活。由于多重耐藥菌株的大量產生，中藥的抑菌作用開始受到人們的關注。中藥抑菌機制尚不清楚，有報道通過對中藥與抗生素作用后菌落直徑大小的比較，提示了中藥成分可能具有與一般抗生素不同的抑菌機制。中藥抑菌成分較多，可作用于細菌的不同部位和繁殖的不同階段，并對細菌的多個代謝環節作用，故不易產生耐藥性[8]。因此研究和開發抗菌中藥具有重要意義。黃芩是中醫在臨床上治療肺炎的常用藥，具有較廣的抗菌譜，這與黃芩的苦寒藥性和“清熱燥濕、瀉火解毒、涼血止血、除熱安胎”的功效有關。黃酮類成分為黃芩藥理活性基礎，而黃芩苷具有多種藥理活性，被認為在很大程度上代替黃芩的功效[7]，所以黃芩的絕大部分藥敏試驗都采用藥材或者黃芩苷粗品。本研究除了選取常用的黃芩苷以外，對其它含量較高的成分也進行了藥理活性的探究，黃芩素為黃芩苷的苷元，在本研究中對金黃色葡萄球菌和肺炎鏈球菌的抑菌效果明顯強于黃芩苷，這為黃芩中其它成分的開發利用提供了實驗依據，也為黃芩素對其它致病菌的抗菌療效提出了可能性。漢黃芩苷、漢黃芩素、野黃芩苷、白楊素、千層紙素5種單體在2 mg/mL對金黃色葡萄球菌及肺炎鏈球菌無抑菌現象,推測其抑菌濃度大于2mg/mL或對此兩種細菌無抑菌活性，有待進一步探討研究。此外，本實驗藥品均使用純品，排除了雜質及其它成分的干擾，避免不同成分間的協同或拮抗作用，為單體成分的抗菌活性提供了理論支持。

[1]周錫欽，梁鴻，路新華，等.中藥黃芩主要黃酮類成分及其生物活性研究[J].北京大學學報:醫學版,2009,41(5):578

[2]楊淑文.32種中草藥抑菌活性的比較研究[J].安徽農業科學，2011，39(3)：1361

[3]劉云波，郭麗華，邱世翠，等.黃芩體外抑菌作用研究[J].時珍國醫國藥,2002,13(10):596

[4]黃志華，徐子琴，樊信澤.單味黃芩治療細菌性肺炎[J].時珍國藥研究,1992,3(3):106

[5]孫冬梅，鄺棗園，李巖，等.黃芩苷對耐藥性金黃色葡萄球菌的抑菌作用研究[J].吉林醫學,2011,32(13):2587

[6]喬亞峰，葉振東.四種中藥對耐藥肺炎鏈球菌的抑菌作用[J].中國微生態學雜志,2009,21(11):995

[7]王娜.中藥黃芪、黃芩有效成分的體外抑菌作用研究[D].秦皇島:燕山大學,2009

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