液相色譜·三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜法測定昆蟲對茚蟲威活化代謝活性的差異

2014-10-24 21:13:46高希武等

分析化學(xué) 2014年4期

高希武等

摘要：采用液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜，建立了測定昆蟲對茚蟲威活化代謝（N脫甲氧羰基反應(yīng)，產(chǎn)物為DCJW）活性的新方法。按本方法制備樣品后30 h內(nèi)，產(chǎn)物DCJW的化學(xué)穩(wěn)定性較好，5次重復(fù)測定的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）為2.1%。本方法的檢出限為0.01 pg，定量限為0.1 pg；DCJW純乙腈溶液、小菜蛾酶促反應(yīng)樣品連續(xù)進(jìn)樣、5次獨(dú)立酶促反應(yīng)樣品分別進(jìn)樣， 3組樣品獨(dú)立測定的RSD分別為0.7%， 1.1%， 2.7%； 3種DCJW添加水平（440，880和2200 pg）的回收率為96.1%～102.9%，RSD為4.8%～9.4%；DCJW在46～2310 pg范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。本方法靈敏度高，操作方便，適用于昆蟲代謝酶系對茚蟲威的活化代謝活性分析。應(yīng)用本方法比較了小菜蛾阿維菌素抗性品系與敏感品系對茚蟲威 N脫甲氧羰基代謝活性差異，結(jié)果表明，小菜蛾抗性品系對茚蟲威N脫甲氧羰基活性是敏感品系的3.43倍，初步推斷小菜蛾對殺蟲劑阿維菌素和茚蟲威可能存在負(fù)交互抗性。

關(guān)鍵詞：液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜；茚蟲威；活化代謝；小菜蛾

1引言

昆蟲體內(nèi)介導(dǎo)殺蟲劑直接代謝的酶系主要包括細(xì)胞色素P450酶系[1]，水解酶系[2]，以及谷胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶系[3]等。昆蟲代謝酶系催化的殺蟲劑代謝具有重要的毒理學(xué)意義，主要表現(xiàn)為解毒代謝與活化代謝，或表現(xiàn)為解毒代謝與活化代謝的某種平衡，其代謝活性高低直接影響著殺蟲劑在昆蟲體內(nèi)的存在形式、作用機(jī)制、生物活性和抗藥性水平等[4]。在昆蟲毒理學(xué)研究中，特別是在殺蟲劑抗藥性生化機(jī)制研究中，為了表征昆蟲酶系的代謝活性在殺蟲劑代謝抗性機(jī)制中的作用，常利用經(jīng)典的光譜方法（紫外可見光度法或熒光光度法）測定昆蟲對多種模式底物或殺蟲劑類似物的代謝活性來表示[5]。近年來，建立了一些相應(yīng)的色譜或色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析方法[6～9]。然而，利用色譜及色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)表征昆蟲對殺蟲劑直接代謝活性的報道卻很少[5]。因為應(yīng)用模式底物（無論一種還是多種底物）表征昆蟲對殺蟲劑的代謝活性是間接的，而測定昆蟲對殺蟲劑本身的代謝活性則更有說服力[1]，所以開發(fā)合適的分析方法，直接測定昆蟲對殺蟲劑的代謝能力，將在昆蟲毒理學(xué)研究中有廣泛的應(yīng)用。

茚蟲威（Indoxacarb， DPXJW062）是美國杜邦公司開發(fā)的新型噁二嗪類殺蟲劑，幾乎對所有鱗翅目害蟲都有防效，其作用機(jī)理是茚蟲威在鱗翅目昆蟲的脂肪體，特別是中腸內(nèi)活化代謝為N脫甲氧羰基代謝產(chǎn)物（Ndecarbomethoxyllated indoxacarb， DCJW），DCJW阻斷害蟲神經(jīng)細(xì)胞中Na+通道，使神經(jīng)細(xì)胞喪失功能而導(dǎo)致害蟲死亡[10，11]。目前，尚無測定昆蟲對茚蟲威活化代謝活性方法的報道。本實(shí)驗建立了高效液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用的多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）分析方法，用于準(zhǔn)確測定昆蟲對茚蟲威的水解活化代謝活性（圖1）[10，11]。本方法選用棉鈴蟲中腸作為酶液，進(jìn)行MRM分析參數(shù)優(yōu)化，分析方法的建立及確認(rèn)是通過小菜蛾酶液的代謝反應(yīng)進(jìn)行的。MRM分析中，以m/z 267.0為定量離子，m/z 207.0， 150.0為定性離子，通過定量分析產(chǎn)物DCJW的生成量，表征茚蟲威的水解活化代謝活性，用于分析小菜蛾阿維菌素抗性品系與敏感品系對茚蟲威活化代謝活性的差異。

3.5小菜蛾阿維菌素抗性品系與敏感品系的茚蟲威N脫甲氧羰基活性比較

小菜蛾抗性與敏感品系催化茚蟲威的N脫甲氧羰基反應(yīng)同時進(jìn)行，結(jié)果表明，小菜蛾阿維菌素抗性品系的茚蟲威N脫甲氧羰基酶活性與敏感品系相比顯著增強(qiáng)，其活性是敏感品系的3.43倍（表2）。這種對茚蟲威活化代謝的增強(qiáng)，初步表明，小菜蛾阿維菌素抗性品系與敏感品系相比，可能對茚蟲威更敏感，即對阿維菌素和茚蟲威可能存在負(fù)交互抗性，該結(jié)果需要通過小菜蛾抗性與敏感品系對茚蟲威的生物測定來驗證。澳大利亞對菊酯類殺蟲劑產(chǎn)生抗性的棉鈴蟲對殺蟲劑茚蟲威更敏感，因而存在負(fù)交互抗性[14]。盡管茚蟲威在鱗翅目昆蟲體內(nèi)易發(fā)生活化代謝，但由于多種抗性機(jī)制的存在，昆蟲仍然會對茚蟲威產(chǎn)生不同程度的抗性[15～17]，因此研究昆蟲對茚蟲威的活化代謝活性具有重要的毒理學(xué)意義。

3.434結(jié)論

本實(shí)驗建立了液相色譜三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜MRM模式表征昆蟲對茚蟲威的N脫甲氧羰基代謝活性的新方法，操作方便，省去了常用的有機(jī)溶劑萃取、濃縮、定容等步驟。本方法結(jié)合了液相色譜的高效分離、三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜MRM分析模式的強(qiáng)定性和高靈敏度的特點(diǎn)，適用于昆蟲對茚蟲威水解活化代謝活性的直接分析，將應(yīng)用于茚蟲威相關(guān)的昆蟲毒理學(xué)研究中。

References

1Feyereisen， R. Comprehensive Molecular Insect ScienceBiochemistry and Molecular Biology， Vol. 4， 2005： 1-77

2Sogorb M A， Vilanova E. Toxicol. Lett.， 2002， 128（13）： 215-228

3Ranson H， Hemingway J. Comprehensive Molecular Insect SciencePharmacology， Vol. 5， 2005： 383-402

4Matsumura F， Krishna Murti C R. Biodegradation of Pesticides. New York： Plenum Press， 1982： 3-17

5Ai G M， Zou D Y， Shi X Y， Li F G， Liang P， Song D L， Gao X W. J. Agric. Food Chem.， 2010， 58： 694-701

6Yamazaki H， Tanaka M， Shimada T. J. Chromatogr. B， 1999， 721（1）： 13-19

7Liu X N， Liang P， Gao X W， Shi X Y. Pestic. Biochem. Physiol.， 2006， 84（2）： 127-134

8Koitka M， Hoechel J， Obst D， Rottmann A， Gieschen H， Borchert H H. Anal. Biochem.， 2008， 381（1）： 113-122

9AI GuoMin， WANG QingMin， Zou DongYun， GAO XiWu， LI FuGen. Chinese J. Anal. Chem. ， 2009， 37（8）： 1157-1160

10Wing K D， Schnee M E， Sacher M， Connair M， Scott M T， Rhodes B G， Ryan D L， Li Y， Gaddamidi V， Brown A M. Archives of Insect Biochemistry and Physiology， 1998， 37（1）： 91-103

11Wing K D， Sacher M， Kagaya Y， Tsurubuchi Y， Mulderig L， Connair M， Schnee M. Crop Protection， 2000， 19： 537-545

12Bradford M M. Anal. Biochem.， 1976， 72： 248-254

13Bearden J C， Jr. Biochim. Biophys. Acta， Protein Struct.， 1978， 533（2）： 525-529

14Gunning R V， Devonshire A L. Proceedings of the BCPC International CongressCrop Science and Technology， Glasgow， U K， 2003， 2： 789-794

15Shono T， Zhang L， Scott J G. Pestic. Biochem. Physiol.， 2004， 80（2）： 106-112

16Sayyed A H， Wright D J. Pest Manage. Sci.， 2006， 62（11）： 1045-1051

17Nehare S， Moharil M P， Ghodki B S， Lande G K， Bisane K D， Thakare A S， Barkhade U P. Journal of AsiaPacific Entomology， 2010， 13（2）： 91-95