反相高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定母乳及奶粉中核苷和核苷酸的含量

張婷婷等

摘要：建立了反相高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定母乳和嬰幼兒奶粉中5種核苷和5種核苷酸含量的方法。樣品經(jīng)溫水溶解后，選擇0.5 %乙酸沉淀蛋白，并用超濾離心管離心過(guò)濾大分子物質(zhì)；采用鍵合較長(zhǎng)碳鏈的Acclaim C30色譜柱為分析柱，以20 mmol/L醋酸銨和乙腈為流動(dòng)相，梯度洗脫分離，流速0.4 mL/min，溫度15 ℃，紫外檢測(cè)波長(zhǎng)260 nm，采用電噴霧正離子模式進(jìn)行電離，選擇反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式進(jìn)行檢測(cè)，外標(biāo)法定量分析。結(jié)果表明，核苷和核苷酸在12 min內(nèi)達(dá)到基線分離，在0.02～100 mg/L范圍內(nèi)，線性關(guān)系好，相關(guān)系數(shù)R>0.999，方法檢出限0.1～0.2 ng，其中CMP， UMP， GMP， U， AMP在1， 10和50 mg/L加標(biāo)水平下的平均回收率在85.2%～104.7%之間，峰面積RSD在0.7 %～2.0%之間（n=6），核苷C， I ， G ， A和核苷酸IMP在0.5， 5和10 mg/L加標(biāo)水平下的平均回收率在85.08%～103.7%之間，峰面積RSD在0.6%～1.7%之間（n=6）。應(yīng)用本方法定性和定量分析母乳和嬰幼兒奶粉中核苷和核苷酸的含量，并且對(duì)紫外和質(zhì)譜測(cè)定的結(jié)果進(jìn)行比較，基本一致。

關(guān)鍵詞：液相色譜；質(zhì)譜；核苷；核苷酸；母乳；奶粉

1引言

核苷是由堿基加上環(huán)狀核糖或脫氧核糖組成，包括腺苷、鳥(niǎo)苷、胞苷、尿苷、肌苷等（圖1）。核苷與磷酸以酯鍵連成核苷酸，成為核酸的組成單位。研究表明，攝入適量的核苷和核苷酸能夠有效降低腹瀉的風(fēng)險(xiǎn)、保持體內(nèi)微生物環(huán)境的平衡、提高免疫功能和調(diào)控脂質(zhì)代謝等[1～4]。母乳中含有多種核苷和核苷酸，而牛奶中一般不含有核苷和核苷酸，因此許多奶制品公司將核苷酸作為重要的添加劑。臨床研究顯示，嬰幼兒奶粉中添加適量的核苷酸，有助于較小嬰兒腸胃的生長(zhǎng)發(fā)育[5]。目前，嬰幼兒奶粉中5種核苷酸（AMP， GMP， UMP， CMP和IMP）的含量有國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)，歐盟規(guī)定嬰兒食品中核苷酸的總含量不超過(guò)5 mg/100 kcal，而美國(guó)規(guī)定的含量上限為16 mg/100 kcal[6，7]。研究者希望深入研究母乳中各種核苷和核苷酸的含量，以此為基礎(chǔ)，生產(chǎn)出各項(xiàng)指標(biāo)更加接近母乳的嬰幼兒奶粉，促進(jìn)嬰幼兒更健康地生長(zhǎng)。

目前，測(cè)定核苷酸的方法包括熒光法[8]、毛細(xì)管電泳法[9，10]、離子交換色譜法[11]、反相高效液相色譜法（RPHPLC）[12]、液相色譜質(zhì)譜法[13～15]等。比色法易受干擾，操作比較復(fù)雜；毛細(xì)管電泳測(cè)定結(jié)果的重現(xiàn)性不好；離子色譜分離核苷酸結(jié)果較好，受基質(zhì)干擾較少，但是流動(dòng)相與質(zhì)譜不兼容；液相色譜方法操作簡(jiǎn)單，分析速度快，重現(xiàn)性較好，但是核苷酸極性較強(qiáng)，在常規(guī)反相色譜柱上保留較弱，而嬰幼兒奶粉基質(zhì)又比較復(fù)雜，容易受到基質(zhì)干擾[16]。

本研究采用Acclaim C30色譜柱，其具有比C18填料更長(zhǎng)的疏水性碳鏈，對(duì)各種核苷和核苷酸具有更高的分辨率，同時(shí)增加了疏水性較弱的胞嘧啶核苷酸與色譜固定相的作用力，避免復(fù)雜基質(zhì)的干擾。以此為基礎(chǔ)，建立了反相高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定5種核苷和5種核苷酸（結(jié)構(gòu)式見(jiàn)圖1）的分析方法，并應(yīng)用于母乳和嬰幼兒奶粉的含量測(cè)定中。本方法快速，靈敏度高，適合于復(fù)雜基質(zhì)樣品的分析。

3.5樣品測(cè)定

按照2.4節(jié)樣品前處理和2.2節(jié)色譜條件進(jìn)行測(cè)定，外標(biāo)法定量分析。分別采用紫外和質(zhì)譜定量分析某品牌奶粉和母乳中核苷和核苷酸的含量，結(jié)果見(jiàn)表6，兩種方法的測(cè)定結(jié)果一致。結(jié)果表明，本方法快速、靈敏度高，可用于對(duì)母乳和嬰幼兒奶粉中核苷和核苷酸含量的測(cè)定，確保核苷和核苷酸在嬰幼兒奶粉中的添加量在合理范圍內(nèi)，接近或達(dá)到母乳的功效。

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