超高效液相色譜—高分辨質(zhì)譜法快速篩查土豆中的多種農(nóng)藥殘留

陳達(dá)煒等

1引言

農(nóng)藥殘留問題一直受到全球關(guān)注，各國在嚴(yán)格限制高毒農(nóng)藥使用的同時(shí)，加強(qiáng)了農(nóng)藥殘留限量標(biāo)準(zhǔn)的制定。我國最新頒布的GB 27632012《食品中農(nóng)藥最大殘留限量》在食品品種及限量方面均提出了更高要求。盡管如此，我國出口農(nóng)產(chǎn)品常因農(nóng)藥殘留超標(biāo)而影響國際貿(mào)易。而且，因農(nóng)藥殘留引起的食物中毒事件時(shí)有發(fā)生[1，2]。因此，建立農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥多殘留的快速篩查方法十分必要。

目前，常采用多殘留分析技術(shù)開展食品及農(nóng)產(chǎn)品中農(nóng)藥殘留檢測[3]，應(yīng)用的主要方法有氣相色譜/質(zhì)譜法[4～6]及液相色譜/質(zhì)譜法[7～9]，且為保證檢測方法的特異性，多采用串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)。但是，由于食物樣品基質(zhì)的復(fù)雜性，在多組分殘留分析中，低分辨質(zhì)譜常出現(xiàn)假陽性，造成結(jié)果誤判。四級桿飛行時(shí)間質(zhì)譜（Q TOF）和靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜（Orbitrap）的發(fā)展在很大程度上彌補(bǔ)了這個(gè)缺陷，被廣泛應(yīng)用于農(nóng)藥殘留的快速篩查[10～13]。普通高分辨質(zhì)譜雖能降低假陽性結(jié)果，但其定量靈敏度不及三重四級桿質(zhì)譜。Q Exactive高分辨質(zhì)譜是將四級桿與Orbitrap相結(jié)合，在一定程度上改善了高分辨質(zhì)譜的定量效果，因此，采用這一技術(shù)不僅提高了農(nóng)藥殘留定性篩查的可靠性，同時(shí)可以獲得具有較高靈敏度的定量結(jié)果[14]。目前，Q Exactive主要應(yīng)用在蛋白質(zhì)組學(xué)的研究領(lǐng)域[15，16]，在小分子化學(xué)污染物的分析應(yīng)用上還相對較少，其良好的應(yīng)用前景值得關(guān)注[12，17]。

本研究以歐盟2013年土豆考核樣品（EUPTFV15）中規(guī)定的175種農(nóng)藥組分為對象，采用Q Exactive高分辨質(zhì)譜作為篩查手段，建立了農(nóng)藥多殘留的快速篩查方法。

2實(shí)驗(yàn)部分

2.1儀器與試劑

Q Exactive四級桿靜電場軌道阱高分辨質(zhì)譜系統(tǒng)及Dionex UltiMate 3000快速高效液相色譜系統(tǒng)（美國ThermoFisher公司）；氮吹儀（美國Organomation公司）；渦旋混合器（美國Scientific Industries公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（日本Eyela公司）。

甲苯、乙腈和甲醇（色譜純，F(xiàn)isher Scientific公司），甲酸和甲酸銨（HPLC級，Tedia公司）；NaCl和無水Na2SO4（分析純，國藥試劑有限公司）；農(nóng)藥標(biāo)準(zhǔn)品（純度>98%，德國DR.Ehrenstorfer公司）；實(shí)驗(yàn)用水為二次蒸餾水。PSA粉、CarbNH2固相萃取柱（美國Agilent公司）。

土豆樣品和空白土豆樣品均為歐盟農(nóng)藥殘留比對實(shí)驗(yàn)室組織的土豆中農(nóng)藥殘留考核樣品（EUPTFV15）。

2.4分析條件

UPLC色譜條件：流動相A為含0.1%甲酸和4 mmol/L甲酸銨的水溶液， B為含0.1%甲酸和4 mmol/L甲酸銨的甲醇溶液。梯度洗脫：0～1 min，10% B；1～10 min，10%～100% B；10～15 min，100% B；15～18 min，100%～10% B。進(jìn)樣量：10 μL；流速200 μL/min；柱溫：40 ℃；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（ 100 mm×2.1 mm， 1.7 μm）。

質(zhì)譜條件：采用HESI離子化方式；噴霧電壓3.5 kV；毛細(xì)管溫度325 ℃；加熱器溫度350 ℃；鞘氣30 arb，輔助氣10 arb；掃描模式為Full Scan/ddMS2，采集范圍m/z 100～800，正離子采集模式；分辨率采用MS Full Scan 70000 FWHM，MS/MS 17500 FWHM，NCE為35 eV。

3結(jié)果與討論

3.1樣品前處理方法的選擇比較了CarbNH2固相萃取柱和以PSA分散固相萃取的兩種凈化方式的效果。175種農(nóng)藥的空白加標(biāo)的定性篩查結(jié)果表明，雖然CarbNH2柱能較好地去除植物提取液中的葉綠素和類胡蘿卜素等色素，但對乙酰甲胺磷、倍硫磷等部分有機(jī)磷類農(nóng)藥有不同程度的吸附，從而造成這些農(nóng)藥無法檢出或回收率低；采用PSA分散固相萃取方法去除雜質(zhì)效果雖不如CarbNH2柱，但對所有的目標(biāo)化合物有較好的回收。Q Exactive具有較高的分辨率和靈敏度，樣品提取液經(jīng)PSA凈化后， 在Q Exactive質(zhì)譜儀上完全可以將干擾物和待測分析物區(qū)分開；同時(shí)，PSA分散固相萃取方法更加簡單快速，適合農(nóng)藥多殘留的快速篩查。

3.2色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化

采用UPLC BEH C18色譜柱分析，比較了純水和含4 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的水溶液作為流動相A，以及甲醇、乙腈和含4 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的甲醇作為流動相B的效果。結(jié)果表明，采用甲醇梯度洗脫，雖柱壓較乙腈更大，但由于樣品基質(zhì)的復(fù)雜性和有機(jī)磷農(nóng)藥的極性較強(qiáng)，甲醇更有利于有機(jī)磷農(nóng)藥的保留以及基質(zhì)雜質(zhì)的洗脫，從而減少雜質(zhì)在色譜柱中殘留，延長色譜柱壽命。在ESI+電離模式下，氨基甲酸酯類和菊酯類農(nóng)藥更易生成響應(yīng)強(qiáng)度更高的[M+NH4]+，在流動相中加入4 mmol/L甲酸銨溶液， 有助于[M+NH4]+的生成；而加入0.1%甲酸，既有利于化合物的離子化，提高化合物的響應(yīng)值，又有利于改善酸性農(nóng)藥的峰形，因此選擇4 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸的水溶液作為流動相A。但在加標(biāo)回收實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，回收率的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差較大（>15%），推測是由于樣品在梯度洗脫中，化合物的離子化不穩(wěn)定造成的，因此在流動相B（甲醇）中同樣加入4 mmol/L甲酸銨和0.1%甲酸，以保證化合物穩(wěn)定的離子化過程，回收率得到明顯改善。

由于Q Exactive質(zhì)譜儀是四級桿質(zhì)譜與Obitrap質(zhì)譜串聯(lián)，具有高分辨率和高靈敏度的特點(diǎn)。與三重四級桿質(zhì)譜以母離子/子離子對為定量手段不同，Q Exactive質(zhì)譜在Full Scan/ddMS2模式下能同時(shí)進(jìn)行全掃描和全范圍二級質(zhì)譜掃描，除具有更好的定性能力外，其以母離子為定量離子，大大簡化了質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化，從而節(jié)省了樣品分析前的準(zhǔn)備時(shí)間，更加有助于樣品的快速篩查和定量分析。

3.3土豆樣品的定性方法

3.3.1多農(nóng)藥的空白加標(biāo)定性篩查本研究以歐盟土豆考核樣品（EUPTFV15）所規(guī)定的175種農(nóng)藥為分析物，以100 μg/L的175種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，考察Q Exactive質(zhì)譜儀的分析檢測能力。結(jié)果表明，在Full Scan模式下，能夠很好地檢測到160種農(nóng)藥，未檢測到的農(nóng)藥主要是有機(jī)氯農(nóng)藥及含氯的農(nóng)藥（見附表）。通過空白土豆樣品對160種能檢測到的農(nóng)藥進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證篩查方法的可靠性，加標(biāo)濃度水平以歐盟考核所規(guī)定的最低報(bào)告水平（MRRL）10 μg/kg為基準(zhǔn)。采用2.3和2.4節(jié)的樣品前處理和分析條件進(jìn)行檢測，應(yīng)用儀器配備的篩查軟件進(jìn)行定性篩查。具體的定性篩查步驟和所得到的160種農(nóng)藥的精確質(zhì)量數(shù)和碎片離子信息見附表。

3.3.2實(shí)際樣品的定性篩查采用上述定性篩查方法，對歐盟考核的空白土豆樣品和土豆樣品進(jìn)行篩查。結(jié)果表明，空白土豆樣品中不含所篩查的160種農(nóng)藥；從考核的土豆樣品中共定性篩查到17種農(nóng)藥殘留，結(jié)果見表1。

References

1http：//www.moh.gov.cn/mohwsyjbgs/s7860/201303/b70872682e614e4189d0631ae5527625.shtml

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12Wang J， Chow W， Leung D， Chang J. J. Agric. Food Chem.， 2012， 60（49）： 12088-12104

13Maria L G P， Patricia P B， Roberto R G， Jose L M V， Antonia G F. J. Chromatogr. A， 2012， 1248（1）： 130-138

14Ganna F， Tomas R， Richard H L， Roman G. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2013， 27（15）： 1751-1762

15Sun L L， Zhu G J， Norman J D. Rapid Commun. Mass Spectrom.， 2013， 27（1）： 157-162

16Susan S B， Vasant R M， Matthew J S， Heather K G， Bruce S K. Anal. Chem.， 2011， 83（17）： 6648-6657

17GUO YanLei， WU MingJun， LI WenJuan， JIANG Zheng， YE FangTing， YU Chao. Chinese J. Anal. Chem.， 2013， 41（7）： 1074-1079

18Paula M P， Antonio V， Tuija P， Sonja M， Miguel G， Milagros M， Carmelo R T， Amadeo R F. J. Agric. Food Chem.， 2011， 59（14）： 7609-7619

3.3土豆樣品的定性方法

3.3.1多農(nóng)藥的空白加標(biāo)定性篩查本研究以歐盟土豆考核樣品（EUPTFV15）所規(guī)定的175種農(nóng)藥為分析物，以100 μg/L的175種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，考察Q Exactive質(zhì)譜儀的分析檢測能力。結(jié)果表明，在Full Scan模式下，能夠很好地檢測到160種農(nóng)藥，未檢測到的農(nóng)藥主要是有機(jī)氯農(nóng)藥及含氯的農(nóng)藥（見附表）。通過空白土豆樣品對160種能檢測到的農(nóng)藥進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證篩查方法的可靠性，加標(biāo)濃度水平以歐盟考核所規(guī)定的最低報(bào)告水平（MRRL）10 μg/kg為基準(zhǔn)。采用2.3和2.4節(jié)的樣品前處理和分析條件進(jìn)行檢測，應(yīng)用儀器配備的篩查軟件進(jìn)行定性篩查。具體的定性篩查步驟和所得到的160種農(nóng)藥的精確質(zhì)量數(shù)和碎片離子信息見附表。

3.3.2實(shí)際樣品的定性篩查采用上述定性篩查方法，對歐盟考核的空白土豆樣品和土豆樣品進(jìn)行篩查。結(jié)果表明，空白土豆樣品中不含所篩查的160種農(nóng)藥；從考核的土豆樣品中共定性篩查到17種農(nóng)藥殘留，結(jié)果見表1。

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3.3土豆樣品的定性方法

3.3.1多農(nóng)藥的空白加標(biāo)定性篩查本研究以歐盟土豆考核樣品（EUPTFV15）所規(guī)定的175種農(nóng)藥為分析物，以100 μg/L的175種農(nóng)藥混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)樣分析，考察Q Exactive質(zhì)譜儀的分析檢測能力。結(jié)果表明，在Full Scan模式下，能夠很好地檢測到160種農(nóng)藥，未檢測到的農(nóng)藥主要是有機(jī)氯農(nóng)藥及含氯的農(nóng)藥（見附表）。通過空白土豆樣品對160種能檢測到的農(nóng)藥進(jìn)行加標(biāo)實(shí)驗(yàn)，驗(yàn)證篩查方法的可靠性，加標(biāo)濃度水平以歐盟考核所規(guī)定的最低報(bào)告水平（MRRL）10 μg/kg為基準(zhǔn)。采用2.3和2.4節(jié)的樣品前處理和分析條件進(jìn)行檢測，應(yīng)用儀器配備的篩查軟件進(jìn)行定性篩查。具體的定性篩查步驟和所得到的160種農(nóng)藥的精確質(zhì)量數(shù)和碎片離子信息見附表。

3.3.2實(shí)際樣品的定性篩查采用上述定性篩查方法，對歐盟考核的空白土豆樣品和土豆樣品進(jìn)行篩查。結(jié)果表明，空白土豆樣品中不含所篩查的160種農(nóng)藥；從考核的土豆樣品中共定性篩查到17種農(nóng)藥殘留，結(jié)果見表1。

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