盲腸結扎穿刺致膿毒性肺損傷大鼠血清MMP－9水平研究＊

陳 昊 ，李曉寧，薛 菲，王 岸，周 超

（上海市周浦醫院呼吸內科，上海 201318）

急性肺損傷（ALI）／急性呼吸窘迫綜合征（ARDS）死亡率達 32%～50%［1］。膿毒癥是 ALI／ARDS的重要病因，膿毒癥時基質金屬蛋白酶（MMPs）激活可能是肺損傷的重要因素［2～4］。目前國內對膿毒性肺損傷MMP－9的研究未見報道。本試驗通過盲腸結扎穿刺研究大鼠膿毒性急性肺損傷MMP－9的血清表達以及肺損傷病理相關性，探討MMP－9在ALI形成及預后判斷的作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 SPF級SD大鼠50只，體重230～250g，購自第二軍大醫學實驗動物中心。

1.2 實驗方法

1.2.1 動物分組及處理 50只SD大鼠完全隨機分為假手術組（SHAM組）8只和CLP手術組42只（6、12、24、48h）。6、12h組各8只，24h組10只和48h組16只。CLP組分別在設定時間處死仍存活的大鼠；SHAM組在48小時后處死作為對照組。

1.2.2 建立CLP致急性膿毒癥性肺損傷動物模型

1.2.2.1 手術組（CLP組） 適應性飼養實驗動物1周，在手術前禁食12h。戊巴比妥納按40mg／kg劑量、腹腔注射麻醉后，將仰臥位大鼠固定在手術板，在中腹手術區去毛和消毒后，用手術刀經腹壁行一約2cm切口，進腹后在以3號絲線在回盲瓣末端分離并結扎盲腸，用50ml針筒針頭在結扎末端穿刺3次，并擠出少許糞便，然后用4號絲線依次逐層縫合腹膜至皮膚。手術完成后皮下注射NS 100ml／kg抗休克。手術組在6、12、24和48h處死實驗大鼠，并留取實驗標本。

1.2.2.2 假手術組（SHAM 組） 在開腹后僅翻動腸道后關腹，不予手術結扎穿刺及皮下注射NS補液。

1.3 評價指標測定

1.3.1 生存率 記錄各實驗組大鼠的實際生存率。

1.3.2 標本采集

1.3.2.1 血清標本采集 在預定時間點處死實驗動物取血置于抗凝管管中，使用低溫離心機（2000r／min）離心30分鐘，取血清后立即凍存在－80℃冰箱中，留待炎癥因子測定。

1.3.2.2 肺組織標本 預定時間點處死實驗組動物后，在無菌條件下開胸取肺，迅速用吸水紙吸取左肺表面水分以及血液，使用電子天平稱重，迅速置于90℃烤箱烘干72小時后，再次稱取干重，并計算肺組織的干／濕重比（W／D）。右肺下葉用10%甲醛固定，留待病理學檢查評分。

1.3.3 炎癥因子測定 MMP－9、IL－8、IL－10、IL－1測定，采用雙抗體夾心E L I S A法檢測，試劑盒均購自上海西塘公司。

1.3.4 病理檢查 取開胸后留存右肺下葉用10%福爾馬林固定后石蠟包埋切片，HE染色，觀察肺組織病理。參照Smith評分法［5］的方法并進行病理評分。

2 結果

2.1 生存率 CLP手術后48小時組大鼠的生存率為31.2%，24小時生存率為60%，12和6小時均無死亡。假手術組無死亡。

2.2 W／D比 對照組W／D水平在CLP手術后6和12小時出現下降（P＜0.01），6和12小時組間無明顯差異（P＞0.05）。24小時組 W／D水平仍下降，同12小時組相比，差異有顯著性（P＜0.01）。48小時組W／D水平出現上升，同24小時組間無統計學差異（P＞0.005），見表1。

表1 肺干濕重比（W／D）比較（）Table 1 W／D of the lung

表1 肺干濕重比（W／D）比較（）Table 1 W／D of the lung

肺病理評分SHAN組 4.62±0.56①分組 W／D 0.67±0.5166h 4.63±0.11① 0.60±0.54812h 4.37±0.13 1.25±0.50024h 4.47±0.09 2.67±0.51648h 4.86±0.04 3.60±0.548

2.3 在本實驗中，MMP－9、IL－8、IL－1、IL－10血清水平變化及統計結果見表2。

表2 盲腸結扎穿刺術后各組血清水平變化情況（）Table 2 MMP－9，IL－8，IL－6and IL－10after CLP

表2 盲腸結扎穿刺術后各組血清水平變化情況（）Table 2 MMP－9，IL－8，IL－6and IL－10after CLP

分組 IL－1（pg／ml） IL－8（pg／ml） IL－10（pg／ml） MMP9（pg／ml）SHAH 組 8.59±7.21 150.15±43.99 13.08±7.61 12.15±5.666h 43.46±25.33 1394.92±109.98 22.52±8.35 9.50±1.8112h 58.84±35.48 1665.12±256.45① 53.09±57.83① 12.47±2.5024h 59.47±37.06 2201.55±147.39② 61.00±20.61② 31.80±3.62②48h 141.33±68.58② 3582.41±2304.93② 60.99±40.09② 45.27±21.38②

2.3.1 CLP手術組大鼠12、24hMMP－9與對照組相比明顯上升（P＜0.01），48小進一步升高（P＜0.01），見圖1－1。

2.3.2 CLP手術組大鼠IL－8各個時間點有持續升高趨勢，12小時組較對照組升高（P＜0.05），24及48小時組較對照組顯著升高（P＜0.01），見圖1－2。

2.3.3 CLP手術組大鼠0～24小時IL－1有持續升高趨勢，48小時組較對照組顯著升高（P＜0.01），見圖1－3。

2.3.4 CLP手術組大鼠，12、24、48hIL－10同對照組相比均升高（P＜0.05），而12、24及48h組未有進一步升高趨勢，見圖1－4。

圖1 水平示意Figure 1 MMDP，IL－8，IL－1and IL－10

2.4 病理情況 對照組及假手術組光鏡下觀察，對照組肺組織結構完整，未有明顯炎癥以及水腫變化。CLP手術后隨造模時間延長肺損傷進行性加重。6小時組未見明顯的肺組織變化；12小時組可見輕微的肺間質增寬，未有明顯水腫、滲出及少量炎性細胞浸潤；24小時組出現肺泡間隔增寬，肺泡腔塌陷，出現大量炎性細胞浸潤，紅細胞滲出，并有支氣管內出血，肺泡結構破壞，見圖2、3。48小時組肺泡間隔增寬進一步加重，大量肺泡組織結構破壞，出現局灶性肺不張和肺氣腫，肺泡間結締組織出現明顯增生，僅少量炎性細胞浸潤，肺泡間出現少量液體滲出，見圖4。病理評分前12小時無明顯變化（P＞0.05），12、24和48h出現增高（均P＜0.01），病理組織評分見表2。

圖2 CLP后24小時肺組織病理 炎癥細胞浸潤（HE染色，×100）Figure 2 Inflammatory cell infiltration 24 hour after CLP

圖3 CLP后24小時肺組織病理 肺出血（HE染色，×100）Figure 3 Pulmonary hemorrhage 24hour after CLP

圖4 CLP后48小時肺組織病理（HE染色，×100）Figure 4 Pulmonary pathology 48hafter CLP

2.5 相關性研究 分別對各組數據進行正態性檢驗，均為正態分布。然后行Pearson相關性分析，再行相關系數的假設檢驗。MMP9等炎癥因子同肺損傷病理評分相關系數（MMP9、IL1、IL8均P＜0.01，IL－10 P＜0.05）MMP9的相關性最高（r＝0.704，P＜0.01），見表3。

表3 MMP－9等炎癥因子同肺損傷病理相關性分析Table 3 The relation of inflammatory factors and pathology of pulmonary injury

3 討論

3.1 膿毒癥性肺損傷動物模型的建立 ALI／ARDS臨床特征是難以糾正的低氧血癥。細胞因子在膿毒癥性肺損傷中其關鍵性作用。既往動物實驗研究以使用直接建立肺損傷的模型方法較多，包括注射油酸、鹽酸吸入等直接建立肺損傷模型的方法。直接肺損傷因素誘發肺損傷出現的時間以及病理過程同膿毒性肺損傷的特征有明顯區別，本實驗主要的研究內容是膿毒癥后的肺損傷，故不考慮使用。而目前膿毒癥模型有內因性中毒模型和細菌感染模型兩種。前者以LPS腹腔注射為主，后者一般使用盲腸結扎穿刺（CLP）手術的方法。在研究膿毒癥繼發肺損傷的動物模型選擇上使用CLP更接近于臨床實際［6］。

本實驗24小時大鼠生存率60%，48小時生存率31.2%，同國外的實驗模型研究的結果基本相同［7］。IL－1、IL－8、IL－10等肺損傷相關炎癥因子明顯升高。更重要的是肺組織病理評分隨時間增加。24小時組及48小時組出現肺泡結構破壞，出現肺泡腔塌陷，出現大量炎性細胞浸潤，氣管內出血，局灶性肺不張和肺氣腫等肺損傷變化。根據肺病理我們考慮大鼠膿毒癥后明顯肺損傷出現于24小時，并在48小時出現肺損傷。膿毒癥后肺損傷的模型可以通過該方法建立。

3.2 細胞因子變化 目前文獻報道與肺損傷有明確關系的炎癥因子主要包括白介素（IL－1、IL－8、IL－10）［8～10］。而本研究中同樣發現以上炎癥因子均出現明顯升高。各種炎癥因子高峰在24～48h出現，表明IL－1等均參與了肺損傷的病理過程。相關性分析表明，IL－10與肺損傷顯著相關。本實驗中IL－10在12小時已出現高峰，肺損傷出現后IL－10水平無明顯變化。IL－10對免疫應答起抑制作用，有實驗表明急性肺損傷患者肺組織中IL－10水平降低提示可能發生急性呼吸窘迫綜合征。IL－10具有明顯的對抗淋巴細胞和中性粒細胞等炎癥細胞在肺組織中浸潤作用，從而減輕肺損傷［11］。本實驗中存活大鼠的IL－10水平持續不下降，也說明IL－10可能抑制膿毒性肺損傷。

IL－1、IL－8與肺病理評分的結果有較高的相關性。IL－1、IL－8和 MMP－9均在24小時后出現進一步升高。炎癥細胞在肺內早期聚集的趨化因子是IL－1，IL－1合成后一部分進入血流，吸引激活各種炎癥細胞并能誘導IL－8產生；IL－8對炎癥細胞有強力的趨化作用。IL－8同其他炎癥因子的區別在于持續升高，48小時仍有明顯繼續升高。在CLP后48小時肺損傷的病理已經轉為慢性的炎癥變化，炎癥細胞浸潤明顯減少，增生開始增多。而IL－1和IL－8膿毒癥中主要作用為趨化炎癥細胞浸潤，這說明膿毒性肺損傷后期MMP－9可能起到更重要的作用［12］。我們認為膿毒癥后期IL－1和IL－8水平增高能誘導MMP－9的表達，并造成肺損傷的進展。

3.3 MMP－9表達的變化 我們發現，MMP－9與肺病理損傷相關性最高。MMP－9與肺損傷的相關系數高于IL－1、IL－8、IL－10。MMP－9在 CLP手術24小時后才出現明顯上升，與IL－1、IL－8和IL－10的表現有明顯區別。CLP后24小時MMP－9與肺損傷同步出現，并在大鼠出現肺損傷的48小時有進一步升高。

在膿毒癥發生后，MMP－9活性的升高能夠大量降解肺泡上皮細胞外基質，并導致肺泡滲出液大量產生，炎癥介質的進一步釋放，引起急性肺損傷的發生。有動物實驗研究表明，MMPS在急性肺損傷中水平升高，肺泡內的免疫復合物誘導了肺損傷；MMP－9還影響對于炎癥細胞通過細胞外基質、基底膜以及內皮細胞層來控制氣道的炎癥［13，14］。另有研究表明，MMP－9同時可以裂解各種細胞因子和促炎因子，轉化為更為強力的炎癥因子，MMP－9在免疫反應中起著調節和放大的作用［15］。在本實驗中 MMP－9的增高同肺病理損傷的發展是同步的。

MMP－9在膿毒癥發生后能降解內皮細胞的基質，同時還可以破壞細胞基底膜、內皮細胞層和細胞外基質，刺激肺泡液滲出同時釋放大量的炎癥介質。另外MMP－9還可以增強炎癥因子效應，誘導中性粒細胞遷移并在肺組織浸潤，刺激肺成纖維細胞，以及肺泡Ⅱ型上皮細胞、血管內皮細胞的實質細胞，再次釋放出 MMPs，從而放大了肺組織的損傷。MMP－9可能在膿毒癥繼發的肺損傷中起到了關鍵性的作用。

既往文獻報道，肺損傷發生后W／D水平上升，本實驗結果同實驗預計不相符。我們考慮在重度CLP后，大鼠出現嚴重膿毒癥出現血管擴張和血液分布異常，血管內皮細胞完整性破壞以及微血栓形成均可以引起血漿外滲有效循環血量不足。同時膿毒癥后大鼠處于高代謝狀態，體液消耗增快。而重度CLP大鼠我們觀察到在術后早期是停止進食飲水，雖然已經進行皮下的常規補液，但結合術后24小時大鼠平均15g以及術后48小時35g的體重下降。在重度CLP下，常規補液量可能是不充足的。大鼠在無有效補充液體情況下出現嚴重休克，由于嚴重的休克出現未出現明顯肺水增加，W／D在前24小時出現下降，而在24小時后大鼠開始飲水休克得到一定代償，在24～48小時出現W／D升高。

4 結論

CLP手術后大鼠24小時出現明顯肺損傷，48小時生存大鼠均可以出現嚴重肺損傷。MMP－9同肺損傷的相關性比IL－1、IL－8、IL－10更明顯。MMP－9的水平上升可能提示肺損傷的發生。MMP－9可能在膿毒癥后肺損傷的形成過程中扮演著關鍵性角色。

［1］陳 昊，張麗葳，李文放.不同劑量烏司他丁對急性肺損傷大鼠MMP－9等炎癥因子調控的研究［J］.中國醫藥導報，2011，8（24）：15－18.

［2］Kong MY，Gaggar A，Li Y，et al.Matrix metalloproteinase activity in pediatric acute lung injury［J］.Int J Med Sci，2009，6（1）：9－17.

［3］Doroszko A，Hurst TS，Polewicz D，et al.Effects of MMP－9 inhibition by doxycycline on proteome of lungs in high tidal volume mechanical ventilation－induced acute lung injury［J］.Proteome Sci，2010，8：3.

［4］Page－McCaw A，Ewald AJ，Werb Z.Matrix metalloproteinases and the regulation of tissue remodelling［J］.Nat Rev Mol Cell Biol，2007，8（3）：221－233.

［5］Smith KM，Mrozek JD，Simonton SC，et al.Prolonged partial liquid ventilation using conventional and high－frequency ventilatory techniques：gas exchange and lung pathology in an animal model of respiratory distress syndrome［J］.Crit Care Med，2007，25（11）：1888－1897.

［6］Fink MP.Animal models of sepsis and its complications［J］.Kidney Int，2008，74（8）：991－993.

［7］Rittirsch D，Huber－Lang MS，Flierl MA，et al.Immunodesign of experimental sepsis by cecal ligation and puncture［J］.Nat Protoc，2009，4（1）：31－36.

［8］Zhou MT，Chen CS，Chen BC，，et al.Acute lung injury and ARDS in acute pancreatitis：mechanisms and potential intervention［J］.World J Gastroenterol，2009，16（17）：2094－2099.

［9］Taniguchi LU，Caldini EG，Velasco IT，et al.Cytoskeleton and mechanotransduction in the pathophysiology of ventilator－induced lung injury［J］.J Bras Pneumol，2010，36（3）：363－371.

［10］Fudala R，Krupa A，Stankowska D，et al.Anti－interleukin－8 autoantibody：interleukin－8immune complexes in acute lung injury／acute respiratory distress syndrome［J］.Clin Sci（Lond），2008，114（6）：403－412.

［11］洪 斌，李 向，陳 沈.TNF－α、PAF、IL－10在急性肺損傷患者血清中的變化及意義［J］.重慶醫科大學學報，2009（6）：772－774.

［12］Li A，Dubey S，Varney ML，et al.IL－8directly enhanced endothelial cell survival，proliferation，and matrix metalloproteinases production and regulated angiogenesis［J］.J Immunol，2003，170（6）：3369－3376.

［13］Wu H，Dong G，Liu H，et al.Erythropoietin attenuates ischemia－reperfusion induced lung injury by inhibiting tumor necrosis factor－alpha and matrix metalloproteinase－9expression［J］.Eur J Pharmacol，2009，602（2－3）：406－412.

［14］Kolaczkowska E，Arnold B，Opdenakker G.Gelatinase B／MMP－9as an inflammatory marker enzyme in mouse zymosan peritonitis：comparison of phase－specific and cell－specific production by mast cells，macrophages and neutrophils［J］.Immunobiology，2008，213（2）：109－124.

［15］Hoffmann U，Bertsch T，Dvortsak E，et al.Matrix－metalloproteinases and their inhibitors are elevated in severe sepsis：prognostic value of TIMP－1in severe sepsis［J］.Scand J Infect Dis，2006，38（10）：867－872.