嚴重高三酰甘油血癥對小鼠生育及其后代糖脂代謝的影響

馬亞紅 阿布杜拉·熱西提 謝北辰 郭 鑫 楊金奎 劉國慶*

(1.北京市普仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100062;2.北京大學心血管研究所教育部分子心血管學重點實驗室，北京100191;3.首都醫(yī)科大學附屬北京同仁醫(yī)院內(nèi)分泌科，北京100730)

流行病學研究［1］表明，高三酰甘油血癥(hypertriglyceridemia，HTG)是動脈粥樣硬化的獨立危險因子之一，同時還會引起多器官的損害，例如胰腺炎［2］、腎功能損害［3］、神經(jīng)系統(tǒng)障礙［4］和糖代謝異常［5］等。

HTG常伴發(fā)于妊娠，因為在正常妊娠過程中，隨著雌激素濃度增加及胰島素抵抗的增強，糖脂代謝將發(fā)生明顯改變。自妊娠中期開始，脂肪貯量增加而利用減少，孕晚期脂肪組織較非妊娠期增加1.5～2.0倍，而血漿三酰甘油(triglycerides，TG)也可升高2～3倍，最高達200～300(1 mg/dL=0.011 3 mmol/L)，然后逐漸下降，在產(chǎn)后6周接近妊娠前濃度［6］。若妊娠前就有高脂血癥，則有可能發(fā)生嚴重HTG而誘發(fā)急性胰腺炎，其時孕產(chǎn)婦病死率為20%～50%，胎兒畸形、流產(chǎn)、早產(chǎn)、生長受限等不良妊娠結(jié)局明顯增高［7-8］。但關(guān)于HTG對后代出生后的遠期影響如糖脂代謝的影響未見報道。

本研究應(yīng)用雌性載脂蛋白CIII(apolipoprotein CIII，Apo CIII)轉(zhuǎn)基因的嚴重HTG小鼠與正常雄性小鼠交配，并以正常雌性及雄性小鼠交配作為對照組，以觀察HTG小鼠是否能正常妊娠、分娩。成年Apo CIII轉(zhuǎn)基因的嚴重 HTG小鼠糖耐量正常［9］，本研究將進一步探討雌性HTG小鼠對幼年后代TG以及與TG代謝密切相關(guān)的糖代謝的影響。

1 材料和方法

1.1 小鼠的制備和繁殖

實驗用C57B6背景的Apo CIII轉(zhuǎn)基因小鼠來源于美國Jackson實驗室，由北京大學醫(yī)學部實驗動物中心SPF級動物房飼養(yǎng)。經(jīng)與ICR背景小鼠雜交5代，得到易于繁殖的ICRApo CIII轉(zhuǎn)基因小鼠用于本實驗，實驗動物許可證號:LA2010－059。

共6只轉(zhuǎn)基因雌性小鼠，與6只正常雄性小鼠交配;6只正常雌性小鼠，與6只正常雄性小鼠交配得到后代。于小鼠出生14 d離乳前1周測定禁食后2 h血漿 TG和總膽固醇 (total cholesterol，TC)濃度，依據(jù)血漿TG濃度將后代分為3組:母親為轉(zhuǎn)基因的正常后代(maternal control，MC)和轉(zhuǎn)基因后代(maternal transgenic，MT)及正常對照組(normal control，NC)。從3組后代中每組采用數(shù)字表法隨機抽取8只進行血脂、血糖和胰島素檢測。

1.2 試驗方法

測量3組后代小鼠出生時體質(zhì)量并監(jiān)測小鼠生長情況，分別于出生3、6、9、12、14、28 d 測量3 組小鼠體質(zhì)量。

將上述3組動物飼養(yǎng)至28 d時即離乳后1周，禁食4 h后內(nèi)眥采血，放入離心管中，肝素抗凝，4℃下4 000 r/min離心10 min，分離出血漿，3組吸取血漿測定血漿 TG、TC、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)和空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)濃度。其中，MT組FBG和FINS在20 000 r/min超速離心30 min后取脂肪層下的去脂血漿進行測定。

3組小鼠過夜禁食16 h(但不禁水)，50%的葡萄糖3g/kg灌胃，灌胃前及灌胃后30、60、90和120 min，內(nèi)眥采血放入離心管中，肝素抗凝，4℃下4 000 r/min離心10 min，分離出血漿測定血漿葡萄糖(blood glucose，BG)，其中MT組在20 000 r/min超速離心30 min后取脂肪層下的去脂血漿進行測定。

1.3 血漿生化檢測

血漿TG和TC、BG濃度均用酶反應(yīng)比色法檢測，應(yīng)用BIO-RAD MODEL 550酶標儀，檢測試劑盒購自北京中生北控科技股份有限公司，詳細操作方法參考試劑盒說明書。

1.4 胰島素檢測

應(yīng)用雙抗體夾心ELISA法測定標本中小鼠胰島素水平，應(yīng)用BIO-RAD MODEL 550酶標儀，檢測試劑盒購自上海依科賽生物制品有限公司，詳細操作方法參考試劑盒說明書。

穩(wěn)態(tài)模型評估胰島素抵抗指數(shù)(homeostasis model assessment-insulin resistant index，HOMA-IR)計算公式如下:HOMA-IR=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.5 統(tǒng)計學方法

使用SPSS11.5進行統(tǒng)計學處理，資料均呈正態(tài)分布，方差齊，均數(shù)以均數(shù)±標準差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析方法及單因素重復測量數(shù)據(jù)方差分析法檢驗，以P＜0.05認為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 Apo CIII轉(zhuǎn)基因?qū)е碌膰乐豀TG對雌性小鼠生育能力無影響

Apo CIII轉(zhuǎn)基因嚴重HTG的雌性小鼠可正常妊娠、分娩及哺乳。6只Apo CIII轉(zhuǎn)基因雌性小鼠與6只正常雄性小鼠交配共得到6窩71只后代，6只正常雌性小鼠，與6只正常雄性小鼠交配;共得到6窩70只后代。測定出生14 d小鼠的血漿TG，其中37只TG濃度＜300 mg/dL，為MC組，33只TG水平＞1500 mg/dL，為MT組。Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠生育后代(MC及MT)數(shù)量與正常雌雄小鼠交配生育的對照組后代(NC)數(shù)量相比，差異無統(tǒng)計學意義(圖1)。同樣，MC及MT組小鼠出生體質(zhì)量及生長速度均與NC組小鼠差異無統(tǒng)計學意義(圖2)。

圖1 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠生育后代數(shù)量與對照組的比較Fig.1 Comparison of litter size between female Apo CIII transgenic mice(♀Apo CIII+♂Apo CIII-)and normal controls(♀Apo CIII-♂Apo CIII-)

圖2 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠生育后代與對照組生育后代的生長曲線Fig.2 The growth curve of Apo CIII transgenic offspring of female mice and the control group offspring

2.2 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的轉(zhuǎn)基因后代血漿TG及TC濃度明顯增高

Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的轉(zhuǎn)基因后代血漿TG及TC水平于出生14及28 d均較非轉(zhuǎn)基因后代及正常對照組顯著升高(P＜0.01)，Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的非轉(zhuǎn)基因后代及正常對照組TG及TC濃度差異無統(tǒng)計學意義，詳見表1。

表1 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的轉(zhuǎn)基因后代血脂水平與其他組的比較Tab.1 Comparisons of lipid testing between maternal transgenic and other groups(±s)

表1 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的轉(zhuǎn)基因后代血脂水平與其他組的比較Tab.1 Comparisons of lipid testing between maternal transgenic and other groups(±s)

*P＜0.01 vs MC and NC group;MT:maternal transgenic;MC:maternal control;NC:normal control;TG:triglycerides;TC:total cholesterol.

TG TC Group 14 days 28 days MT 4 276.9±1 766.0* 3 148.9±803.7* 572.4±127.6* 444.8±117.9 14 days 28 days*MC 212.8±131.5 84.6±20.5 235.8±81.2 118.8±21.5 NC 205.3±87.0 72.9±22.7 265.9±40.8 126.3±13.4

2.3 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的母轉(zhuǎn)基因后代離乳后幼鼠發(fā)生糖耐量異常和胰島素抵抗

3組動物的FBG差異無統(tǒng)計學意義，但MT組小鼠灌胃后30 min BG顯著高于MC、NC組(P＜0.01)，3組動物灌胃后60、90和120 min BG比較，差異均無統(tǒng)計學意義。Apo CIII轉(zhuǎn)基因雌鼠的HTG后代表現(xiàn)為輕度糖耐量受損，而Apo CIII轉(zhuǎn)基因雌鼠所產(chǎn)的非HTG后代則糖耐量正常，與對照組比較，差異無統(tǒng)計學意義(圖3)。MT組小鼠FINS濃度較其他2組明顯增高(P＜0.05)，HOMA-IR也較其他2組增高(P＜0.05)。這提示MT組幼鼠在出生后28 d已經(jīng)出現(xiàn)胰島素抵抗(圖4)。

圖3 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的轉(zhuǎn)基因后代口服葡萄糖耐量實驗與其他組的比較Fig.3 Comparison of oral glucose tolerance tests results among maternal transgenic and other groups

圖4 Apo CIII轉(zhuǎn)基因的雌性小鼠的轉(zhuǎn)基因后代Fins及HOMA-IR與其他組的比較Fig.4 Comparison of fasting insulin and HOMA-IR among maternal transgenic and other groups

3 討論

HTG主要由富含三酰甘油脂蛋白(triglyceriderich lipoproteins，TRLs)的代謝障礙所引起，是代謝綜合征的主要表現(xiàn)之一。環(huán)境因素在HTG的發(fā)生中起重要作用，如高脂、高碳水化合物的飲食習慣，缺乏體力活動等。遺傳因素如水解TRLs中三酰甘油的脂蛋白脂酶(lipoprotein lipase，LPL)及調(diào)控LPL活性的載脂蛋白、轉(zhuǎn)運體、活化因子等基因的變異，可通過與環(huán)境因素的相互作用而影響HTG的發(fā)生，在脂代謝中發(fā)揮重要作用。Apo CⅢ作為對代謝TRLs起重要作用的 LPL的抑制物［10］，與 HTG 的發(fā)生密切相關(guān)［11］。最近有關(guān)Apo CⅢ的重要發(fā)現(xiàn)［12］為一種雜合的Apo CⅢ突變體(R19X)人群血漿Apo CⅢ和TG下降。同時，其血管造影證實的冠狀動脈粥樣硬化發(fā)生率明顯低于對照人群。研究［12］結(jié)果表明，Apo CⅢ的R19X突變是一個有益突變。家族性高三酰甘油血癥(familial hypertriglyceridemia，F(xiàn)HTG)是一種常染色體顯性遺傳性疾病，在一般人群中患病率為1/400～1/300，其血漿三酰甘油濃度通常為 300～800 mg/dL［13］，而Apo CIII轉(zhuǎn)基因小鼠血漿TG濃度是正常對照的5～10倍［14］，在普通喂養(yǎng)的條件下其TG濃度可達到300 mg/dL 以上［14］。

本研究應(yīng)用Apo CIII轉(zhuǎn)基因小鼠，建立了經(jīng)母系遺傳的嚴重HTG后代，同時獲得血漿三酰甘油水平正常的陰性的同窩對照后代。Apo CIII轉(zhuǎn)基因介導的嚴重HTG按照孟德爾規(guī)律遺傳，母系的后代中基本是一半為正常，一半為Apo CIII轉(zhuǎn)基因的嚴重HTG。MT及MC組小鼠出生體質(zhì)量及生長速度均與NC組小鼠差異常無統(tǒng)計學意義，顯示Apo CIII轉(zhuǎn)基因造成的雌鼠嚴重HTG對后代不同基因型的個體發(fā)育沒有明顯影響。

然而，本研究組發(fā)現(xiàn)，MT組的TG和TC濃度在哺乳期和離乳后比MC及NC非常顯著增高，而MC及NC TG及TC濃度比較差異無統(tǒng)計學意義。母系遺傳HTG幼年小鼠(MT)的糖耐量異常、空腹胰島素水平較MC、NC組明顯增高，對血漿空腹葡萄糖濃度沒有影響;根據(jù)血漿空腹胰島素和血糖水平計算的HOMA-RI依然是MT組最高，且差異有統(tǒng)計學意義。結(jié)果提示，Apo CIII轉(zhuǎn)基因的嚴重HTG母親對幼年后代的糖脂代謝的影響只針對于轉(zhuǎn)基因后代。糖尿病患者經(jīng)常伴有脂代謝異常(HTG和低HDL為主)［15］。其原因可能是，胰島素抵抗可明顯促進肝臟VLDL的合成和分泌形成HTG，但原發(fā)性HTG對糖代謝的影響尚不明確。Pollex等［16］發(fā)現(xiàn)，一種LPL基因突變?nèi)巳?LPL291)的HTG與2型糖尿病有正相關(guān)性，也意味著HTG可能會導致糖代謝異常。筆者之前的實驗研究［5］發(fā)現(xiàn)，LPL基因缺陷導致的嚴重 HTG小鼠有明顯的一相胰島素分泌減少，且在高齡期發(fā)生胰島素抵抗和胰腺β細胞增生。結(jié)合本研究新發(fā)現(xiàn)的母系遺傳HTG可以促進胰島素抵抗，說明不同原因的原發(fā)性HTG是有可能對糖代謝產(chǎn)生一定影響的。然而，Reaven等［17］曾經(jīng)應(yīng)用相同嚴重HTG的Apo CIII轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)在正常條件和鏈霉硫脲(streptozocin，STZ)誘發(fā)糖尿病后，其機體糖代謝改變與非轉(zhuǎn)基因?qū)φ招∈蟛町悷o統(tǒng)計學意義。而本研究發(fā)現(xiàn)母系遺傳的嚴重HTG會影響幼年后代糖代謝。由于在轉(zhuǎn)基因動物的繁育中，通常是以轉(zhuǎn)基因父本與非轉(zhuǎn)基因母本交配而產(chǎn)生轉(zhuǎn)基因后代，或混合了母系和父系遺傳的轉(zhuǎn)基因后代進行研究，因此，未來有必要進一步研究經(jīng)母系和父系遺傳的HTG對后代糖脂的代謝影響有無差異。

本研究雖然未能對母系遺傳HTG促進胰島素抵抗的發(fā)生機制進行探索，但表觀遺傳很有可能起到重要作用。表觀遺傳現(xiàn)象發(fā)生在環(huán)境因素和基因組的互作界面，如ApoE基因缺陷小鼠母親的高膽固醇血癥導致基因組某些區(qū)域的基因甲基化和/或染色質(zhì)的修飾從而引起膽固醇合成的基因影響胚胎的通過誘導甲基化或去甲基化活性的增加，對基因組某些區(qū)域進行了修飾，從而增加了后代對動脈粥樣硬化的易感性［18-20］。這些發(fā)現(xiàn)表明，母親體內(nèi)環(huán)境的負性改變導致了胚胎中某些基本的細胞過程發(fā)生了重編程，由此可能導致母系和父系遺傳對后代的不同作用，而確切機制還需要進一步的研究，如果在嚴重HTG患者中母系遺傳也會影響后代的糖代謝，這對臨床實踐是有指導意義的。

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