血管緊張素1-7降低脂肪細胞氧化應激增加脂聯素表達

劉 暢 曹 曦 楊芳遠 張雪蓮 袁明霞 楊金奎

(首都醫科大學附屬北京同仁醫院內分泌科，北京100730)

近十年來，關于腎素－血管緊張素(renin-angiotensin system，RAS)系統抑制劑的研究都是圍繞著其在高危人群中延緩2型糖尿病發生的臨床作用［1］。同時，RAS的幾個新的成員血管緊張素轉換酶2(angiotensin-converting enzyme 2，ACE2)，血管緊張素(1－7)［angiotension(1－7)，Ang-(1－7)］、Mas受體等也陸續被發現。2002年，研究者［2］發現了Ang-(1－7)的特異性受體Mas，使RAS從傳統的ACE-AngⅡ-AT1軸擴展出新的ACE2-Ang-(1－7)-Mas軸，為心血管疾病及糖代謝異常疾病的治療提供了新的靶點。ACE2可以降解AngⅡ為Ang-(1－7)對于傳統的RAS系統有負性調節的作用，Ang-(1－7)通過Mas受體與AngⅡ起相反的作用。

在外周組織中，AngⅡ可以通過增加氧化應激的發生從而誘導胰島素抵抗［3］。AngⅡ可以刺激胞質中NADPH氧化酶的表達增加從而增加細胞中活性氧(ROS)的水平［4-5］。同時AngⅡ可以降低脂肪細胞及骨骼肌細胞中胰島素受體底物(insulin receptor substrate，IRS－1)依賴的胰島素通路的表達，通路中各蛋白磷酸化激活及促進葡萄糖轉運體4(GLUT－4)的膜轉位［6］。最近的研究［7-8］表明 Ang-(1 －7)可以對抗AngⅡ的作用從而增加胰島素誘導的Akt的磷酸化。Santos等［7］報道Mas受體敲除小鼠更易進展為代謝綜合征，出現代謝紊亂的臨床表現。以上研究表明Ang-(1－7)在改善胰島素抵抗及維持葡萄糖穩態中起到重要作用。然而Ang-(1－7)在脂肪組織和骨骼肌組織中對于氧化應激及其相關的葡萄糖代謝的作用尚未有報道。

本研究中，筆者檢測了ACE2-Ang-(1－7)-Mas軸在對抗氧化應激的損傷及增加脂肪細胞胰島素敏感性因子脂聯素的表達中的作用。Mas受體的拮抗劑A779可以抵消Ang-(1－7)的作用。

1 材料與方法

1.1 脂肪細胞培養及預處理

3T3-L1脂肪細胞的誘導分化及培養:將3T3-L1前脂肪細胞按80%密度接種在12孔板中，用含有10%FBS的DMEM高糖培養基在37℃、5%CO2條件下的細胞孵箱中培養。待細胞生長至完全融合2 d后開始誘導:含有0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松和5 mg/L INS、10%FBS的高糖DMEM培養基中培養72 h，更換為含有5 mg/L INS、10%FBS的高糖DMEM培養基繼續培養72 h，之后用含有10%FBS的高糖DMEM培養基，以后每48 h換液1次。誘導8～10 d后90%以上細胞呈脂肪細胞表型，細胞內充滿大小不等的脂滴，可用于后續實驗。實驗分組:①對照組;②Ang-(1 －7)10－9組;③Ang-(1 －7)10－9﹢ A779 10－6組;④葡萄糖氧化酶(GO)50 mU/mL;⑤GO 100 mU/mL;⑥GO 100 mU/mL+Ang-(1 －7)10－9組。

1.2 活性氧(ROS)熒光探針-DHE檢測細胞ROS的表達

本實驗采用ROS熒光探針-DHE，應用流式細胞儀檢測INS－1細胞ROS的表達。流式細胞分析操作方法為采用480～535 nm波長激發，測定590 nm～610 nm以上的發射，細胞可以分成2個亞群:ROS陰性細胞僅有很低的熒光強度，ROS陽性細胞有較強的紅色熒光。其工作濃度為1 μmol/L。

DHE染色步驟:①準備好上述細胞及DHE染色液。用PBS溶液將DHE原液稀釋至工作濃度，為1 μmol/L。②上述細胞用PBS液漂洗2～3次后，除空白對照組外，其余各組均加入2 mL的DHE工作液，37℃溫育20 min。空白對照組用于流式檢測的背景對照。③吸去染色液，PBS漂洗2～3次，每孔加入400 μL胰蛋白酶細胞消化液，消化1～2 min。④每孔加入預冷PBS 1 mL，終止消化反應，吹打混勻。⑤集細胞懸液，離心，棄上清。⑥管樣品加入500 μL PBS溶液，上機檢測。

1.3 NBT還原實驗檢測活性氧

NBT還原實驗檢測活性氧法作用原理:淡黃色的四氮唑基經還原后可以變成紫黑色的甲月簪基，可檢測其吸光度。

細胞接種在12孔細胞培養板中，分為以下幾組:①對照組;②Ang-(1 －7)10－9組;③Ang-(1 －7)10－9﹢A779 10－6組，每組4個副孔。每組細胞在含0.2%NBT的磷酸鹽緩沖液PBS中避光孵育90 min。然后加入50%冰醋酸溶液，用酶標儀檢測560 nm各組的吸光度OD值。在倒置顯微鏡下顯色并拍照。

1.4 提取RNA，反轉錄及實時定量PCR

1)RNA提取:將細胞培養瓶從孵箱取出，鏡下觀察細胞分化程度、狀態等，吸出培養液。用PBS洗3次。Trizol 1 mL吹起細胞，移至無RNA酶的EP管中，室溫5 min，充分裂解。加入氯仿0.2 mL用手用力震蕩 15 s，冰上靜置 10 min。4離心 12 000 g，15 min。小心吸上清于新管中，0.5 mL的異丙醇輕輕顛倒震蕩冰上靜置 15 min。4℃離心 12 000 g，15 min。棄上清，沉淀中加75%的乙醇(溶于DEPC水中)顛倒混勻，4℃離心7 400 g，10 min。棄上清，風干沉淀5～10 min去乙醇。重新溶解沉淀于15～20 μL DEPC水中。－70℃保存。

2)反轉錄:RNA的熱變性:RNase Free H2O210 μL;Oligo(dT)20(10 pmol/ μL)1 μL;Total RNA 2 μg;65 ℃，5 min;置于冰上。

反應液配置:第1步變性后的RNA溶液12 μL;5× RT Buffer 4 μL;dNTP Mixture(各 10 mmol/L)2 μL;RNase Inhibitor(10U/ μL)1 μL;Rever Tra Ace 1 μL;總體積 20 μL。

反轉錄反應:30℃ 10 min→42℃ 20 min→99℃ 5 min→4℃ 5 min→ 瞬間離心。片段較長時，可適當延長此步驟時間(20～60 min)。由于反轉錄酶在反應后和cDNA結合，所以在99℃下進行5 min的熱處理。

3)實時定量PCR

反應液的配制:蒸餾水16 μL，SYBR?Green Realtime PCR Master Mix 25 μL，上游引物(10 μmol/L)2 μL，下游引物(10μmol/L)2μL，樣品溶液 5 μL，總體積 50 μL，體系:15 μL(兩步法，退火/延伸溫度 60℃)，PCR循環(×40循環):95℃ 15 s→60℃ 60 s。

4)所用引物:

TNF-α:5'-CGTCGTAGCAAACCACCAAG-3';5'-TTGAAGAGAACCTGGGAGTAGACA-3';IL-6:5'-TGGGAAATCGTGGAAATGAG-3'; 5'-CTCTGAAGGACT CTGGCTTTG-3';Adiponectin:5'-TGGAGAGAAGGGAGAGAAAGG-3';5'-TGGTCGTAGGTGAAGAGAACG-3';18S:5'-TCAAGAACGAAAGTCGGAGG-3';5'-GGACATCTAAGGGCATCACA-3'。

1.5 統計學方法

所有數據資料均采用SPSS 10.0進行統計處理。實驗數據以均數±標準差(±s)表示，組間差異采用One-way ANOVA分析檢驗。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 Ang-(1－7)減少成熟脂肪細胞ROS水平

DHE探針結合后經流式細胞術的方法檢測成熟脂肪細胞中ROS水平，結果顯示:Ang-(1－7)可以減少成熟脂肪細胞中的熒光強度即ROS水平，差異有統計學意義(P＜0.01)，而Mas受體拮抗劑A779可以逆轉這種作用(P＜0.01)(圖1，表1)。

表1 各組脂肪細胞DHE染色熒光強度Tab.1 DHE intensity of each group(±s)(n=3)

表1 各組脂肪細胞DHE染色熒光強度Tab.1 DHE intensity of each group(±s)(n=3)

＊＊P ＜0.001 vs control group;DEH:dihydroethidium.

Group DHE intensity Control 1.00 ±0.02 Ang－ (1 －7) 0.81 ±0.04＊＊Ang－(1 －7)+A779 1.05 ±0.03＊＊

圖1 各組脂肪細胞DHE染色熒光強度Fig.1 DHE intensity of each group(n＞3)

經NBT還原實驗的方法檢測NBT還原后的吸光度，結果顯示，Ang-(1－7)可以減少成熟脂肪細胞NBT還原后的吸光度即ROS的產生水平(P＜0.001)，而Mas受體拮抗劑A779可以逆轉這種作用(P ＜0.05)(圖2，表2)。

圖2 各組脂肪細胞NBT染色OD(560)值Fig.2 NBT reduction OD(560)of each group(n=7)NBT:tetranitroblue tetrozolium chloride.

表2 各組脂肪細胞NBT染色OD(560)值Tab.2 NBT reduction OD(560)of each group (x ± s，n=7)

2.2 氧化應激降低脂聯素的mRNA表達

分別在分化成熟的脂肪細胞中加入50 mU/mL及100 mU/mL的GO培養12 h建立氧化應激的濃度梯度模型。定量PCR的方法檢測脂聯素的表達，結果顯示，脂聯素的表達隨GO濃度的增加而降低，差異有統計學意義。氧化應激損傷降低了脂聯素的表達從而減少脂肪細胞的胰島素敏感性增加胰島素抵抗(圖3)。

圖3 各組脂肪細胞中脂聯素mRNA表達Fig.3 Adiponectin relative expression of each group(n=8)

2.3 Ang-(1－7)通過降低氧化應激水平從而增加脂聯素的mRNA表達

在已建立的氧化應激模型中加入Ang-(1－7)及A779分別檢測脂聯素的表達。結果顯示，GO濃度為100 mU/mL條件下脂聯素表達降低72%(P＜0.05)，同時加入Ang-(1－7)后可以逆轉脂聯素表達的減低，脂聯素的表達升高了10倍(P＜0.05)。單獨加入Ang-(1－7)組脂聯素的表達較空白對照組升高了9.27倍，差異有統計學意義(P＜0.05)。同時加入Ang-(1－7)及A779組脂聯素的表達顯著下降(P＜0.05)(圖4)。

2.4 Ang-(1－7)對炎性反應因子IL-6和 TNF-α的mRNA表達的影響

圖4 各組脂肪細胞中脂聯素mRNA表達Fig.4 Adiponectin relative expression of each group (n=3)

實時定量PCR方法檢測Ang-(1－7)及A779對其他與脂肪細胞氧化應激及葡萄糖攝取相關炎性反應因子IL-6和TNF-α的mRNA水平表達的影響。結果顯示，Ang-(1－7)及 A779對于 IL-6和 TNF-α的mRNA水平表達沒有顯著性影響(P＞0.05)(圖5、6，表3、4)。

圖5 各組脂肪細胞中炎性反應因子IL-6 mRNA表達Fig.5 IL-6 relative expression of each group(n=3)

圖6 各組脂肪細胞中炎性反應因子TNF-α mRNA表達Fig.6 TNF-α relative expression of each group(n=3)

表3 各組脂肪細胞中炎性反應因子IL-6 mRNA表達Tab.3 IL-6 relative expression of each group(x ± s，n=3)

表4 各組脂肪細胞中炎性反應因子TNF-α mRNA表達Tab.4 TNF-α relative expression of each group(x ± s，n=3)

3 討論

氧化應激在2型糖尿病的發生和發展中起到關鍵作用［9-10］。多項臨床和亞臨床的研究［11-12］指出氧化應激在2型糖尿病發生的病理過程中起關鍵作用。氧自由基和過氧化氫作為兩個強氧化劑被稱為活性氧(ROS)，在血糖失衡及靶器官損傷中起作用。氧化應激可以減低外周組織對胰島素的敏感性并且降低血糖的代謝利用。在本研究中，筆者首次提出外源性的Ang-(1－7)處理可以減少分化成熟的脂肪細胞中ROS的水平。

胰島素抵抗是細胞或組織對于胰島素作用低于正常生理水平的狀態，也是2型糖尿病的特征［13-14］。脂肪組織是餐后血糖首先作用的器官［15-16］。最近一項研究［7］表明Mas受體敲除小鼠更易出現以胰島素敏感性降低為特征的胰島素抵抗，葡萄糖耐量受損及脂肪組織葡萄糖攝取率下降。提示Ang-(1－7)/Mas軸可作為胰島素增敏劑而起作用。

雖然TNF-α和IL-6的mRNA水平表達沒有顯著性變化，但是Ang-(1－7)處理組顯示出脂聯素mRNA水平顯著性的增高。脂聯素是一種血漿細胞因子，它在脂代謝、胰島素敏感性及抗炎過程中起到調節的作用［17-18］。降低的血清的脂聯素水平是在人和動物體內出現肥胖和胰島素抵抗的共同特征［19］。這些結果指出了Ang-(1－7)可以通過增加脂聯素的基因表達水平從而改善脂肪細胞的胰島素抵抗。另外，分化成熟的脂肪細胞表現出隨著過氧化氫濃度增高脂聯素表達降低的狀態，并且氧化損傷對于脂聯素的表達起到負調節作用［20］。

在本研究中，筆者提出Ang-(1－7)抵抗氧化應激并同時升高脂聯素的表達水平。由葡萄糖氧化酶有誘導的輕微的氧化損傷可以顯著的降低脂聯素的mRNA水平表達，并且這種降低是劑量依賴性的。因此，Ang-(1－7)通過增加脂聯素的表達從而對抗氧化應激損傷也可能成為Ang-(1－7)改善胰島素抵抗的一個可能機制。

脂肪組織作為一個重要的內分泌器官在糖類及脂代謝過程中起到關鍵的作用［21］，很多RAS通路的成員都在脂肪組織中表達［22］。研究［23］表明 Ang-(1－7)可以對抗Ang-II的作用，并且作為ACE的抑制劑。Ang-II可以誘導氧化應激增加胰島素抵抗。Ang-(1－7)，在RAS中作為Ang-II的對抗劑，有可能參與到抗氧化應激減少胰島素抵抗的過程中，并在其中起到保護的作用。另外，Ang-(1－7)/Mas軸可以在脂肪組織、肝臟、骨骼肌、內皮細胞及心臟中激活磷酸肌醇－3激酶 (PI3K)/Akt信號通路，此信號通路的激活也可能成為Ang-(1－7)/Mas軸的作用機制。Ang-(1－7)/Mas軸可以誘導脂肪組織中Akt蘇氨酸(308)和絲氨酸 (473)位點磷酸化，從而激活胰島素作用通路，增加葡萄糖的攝取。選擇性Mas受體拮抗劑A779可以阻斷Ang-(1－7)誘導活化的PI3K/Akt信號通路。對果糖喂養的代謝綜合征大鼠模型進行慢性持續注射Ang-(1－7)治療，可以重新激活脂肪細胞中IR/IRS－1/PI3K/Akt信號通路，使其正常化。這些結果表明，Ang-(1－7)增加葡萄糖攝取的機制中包括其對于胰島素作用信號通路的激活。

總之，本研究表明Ang-(1－7)可以通過Mas受體對抗氧化應激損傷從而增加脂肪細胞脂聯素的表達，最終增加外周組織脂肪細胞的敏感性。其主要機制包括Ang-(1－7)可以通過Mas受體降低ROS的產生及促進胰島素敏感性因子脂聯素的表達。結合文獻報道［7］Mas受體敲除小鼠易發生胰島素抵抗和本研究結果，可以得出Ang-(1－7)通過Mas受體可以對抗氧化應激，其機制至少包括對抗氧化應激和增加脂聯素表達過程兩方面。

［1］No authors listed.Correction:effects of an angiotensinconverting-enzyme inhibitor，ramipril，on cardiovascular events in high-risk patients［J］.N Engl J Med，2000，342(18):1376.

［2］Alenina N，Bader M，Walther T.，et al Imprinting of the murine MAS protooncogene is restricted to its antisense RNA［J］.Biochem Biophys Res Commun，2002，290(3):1072-1078.

［3］Strazzullo P，Galletti F.Impact of the renin-angiotensin system on lipid and carbohydrate metabolism［J］.Curr Opin Nephrol Hypertens，2004，13(3):325-332.

［4］Muscogiuri G，Chavez A O，Gastaldelli A，et al.The crosstalk between insulin and renin-angiotensin-aldosterone signaling systems and its effect on glucose metabolism and diabetes prevention［J］.Curr Vasc Pharmacol，2008，6(4):301-312.

［5］Wei Y，Sowers J R，Nistala R，et al.Angiotensin II-induced NADPH oxidase activation impairs insulin signaling in skeletal muscle cells［J］.J Biol Chem，2006，281(46):35137-35146.

［6］Giani J F，Gironacci M M，Munoz M C，et al.Angiotensin-(1 7)stimulates the phosphorylation of JAK2，IRS－1 and Akt in rat heart in vivo:role of the AT1 and Mas receptors［J］.Am J Physiol Heart Circ Physiol，2007，293(2):H1154-1163.

［7］Santos S H，Fernandes L R，Mario E G，et al.Mas deficiency in FVB/N mice produces marked changes in lipid and glycemic metabolism［J］.Diabetes，2008，57(2):340-347.

［8］Niu M J，Yang J K，Lin S S，et al.Loss of angiotensinconverting enzyme 2 leads to impaired glucose homeostasis in mice［J］.Endocrine，2008，34(1 －3):56-61.

［9］GiaccoF，Brownlee M.Oxidative stress and diabetic complications［J］.Circ Res，2010，107(9):1058-1070.

［10］Sarfstein R，Gorzalczany Y，Mizrahi A，et al.Dual role of Rac in the assembly of NADPH oxidase，tethering to the membrane and activation of p67phox:a study based on mutagenesis of p67phox-Rac1 chimeras［J］.J Biol Chem，2004，279(16):16007-16016.

［11］WeyerC，Funahashi T，Tanaka S，et al.Hypoadiponectinemia in obesity and type 2 diabetes:close association with insulin resistance and hyperinsulinemia［J］.J Clin Endocrinol Metab，2001，86(5):1930-1935.

［12］Wu X，Motoshima H，Mahadev K，et al.Involvement of AMP-activated protein kinase in glucose uptake stimulated by the globular domain of adiponectin in primary rat adipocytes［J］.Diabetes，2003，52(6):1355-1363.

［13］Hattori Y，Akimoto K，Gross S S，et al.Angiotensin-II-induced oxidative stress elicits hypoadiponectinaemia in rats［J］.Diabetologia，2005，48(6):1066-1074.

［14］崔常清.胰島素抵抗的機制與臨床研究進展［J］.中國煤炭工業醫學雜志，2012，15(7):1119-1121.

［15］Fukuoka H，Iida K，Nishizawa H，et al.IGF－I stimulates reactive oxygen species(ROS)production and inhibits insulin-dependent glucose uptake via ROS in 3T3-L1 adipocytes［J］.Growth Horm IGF Res，2010，20(3):212-219.

［16］楊晶，裴麗娜，都健，等.胰島素抵抗大鼠脂肪組織chemerin mRNA的表達和意義［J］.中國醫科大學學報，2012，41(1):35-37.

［17］Munoz M C，Giani J F，Dominici F P.Angiotensin-(1－7)stimulates the phosphorylation of Akt in rat extracardiac tissues in vivo via receptor Mas［J］.Regul Pept，2010，161(1－3):1-7.

［18］南楠，金澤寧，楊澤.脂聯素基因多態性與2型糖尿病合并冠心病的關聯研究［J］.首都醫科大學學報，2012，33(4):6-11.

［19］Sampaio W O，Souza dos Santos R A，Faria-Silva R，et al.Angiotensin-(1 － 7)through receptor Mas mediates endothelial nitric oxide synthase activation via Akt-dependent pathways［J］.Hypertension，2007，49(1):185-192.

［20］Furukawa S，Fujita T，Shimabukuro M，et al.Increased oxidative stress in obesity and its impact on metabolic syndrome［J］.J Clin Invest，2004，114(12):1752-1761.

［21］Nakanishi S，Yamane K，Kamei N，et al.A protective effect of adiponectin against oxidative stress in Japanese Americans:the association between adiponectin or leptin and urinary isoprostane［J］.Metabolism，2005，54(2):194-199.

［22］Newsholme P，Haber E P，Hirabara S M，et al.Diabetes associated cell stress and dysfunction:role of mitochondrial and non-mitochondrial ROS production and activity［J］.J Physiol，2007，583(Pt 1):9-24.

［23］Ferreira A J，Santors R A.Cardiovasular actins of angiotensin-(1 －7)［J］.Braz J Med Biol Res，2005，38(4):499-507.