超黃金治療期的缺血性中風大鼠模型、治療模式及療效表述

蔣雪云 張穎潔 趙 明*

(1.首都醫科大學醫學實驗與測試中心，北京100069;2.首都醫科大學化學生物學與藥學院，北京100069)

腦卒中俗稱中風，臨床將中風分為缺血性中風和出血性中風兩種類型。缺血性中風患者的主要癥狀包括猝然昏倒、不省人事、口角歪斜、語言不利，以及半身不遂。缺血性中風發病率高、病死率高、致殘率高、復發率高，預后差。缺血性中風、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病(以下簡稱冠心病)和癌癥在臨床上并列為威脅人類健康的三大疾病。溶栓是臨床治療缺血性中風的唯一方案。組織纖溶酶原激活劑(tPA)是缺血性中風唯一有效的臨床治療藥物。由于缺血性中風和出血性中風早期癥狀不易鑒別，而tPA有嚴重的出血不良反應，以及由于缺血性中風治療受3 h黃金期限制，可用tPA施救的機會很少。創造無出血不良反應的缺血性中風治療藥物一直是新藥研究的前沿［1-5］。形成對照的是，缺血性中風動物模型研究甚少。基于筆者對血栓治療藥物研究的長期興趣和療效判斷的自身需求，本文研究了長時缺血性中風大鼠模型及其治療模式和療效表述。

1 材料與方法

1.1 大鼠的選擇

首都醫科大學倫理委員會認為，這里描述的大鼠實驗方案符合日內瓦動物試驗指南。體質量280～305 g的清潔級健康雄性SD大鼠［實驗動物許可合格證號:SCXK(京)2006－0009］，購自維通利華實驗動物中心。文獻［6-10］認為，SD大鼠和Wistar大鼠都可制造缺血性中風模型。對比兩種大鼠，筆者發現價格低的SD大鼠種系純合性好，腦血管變異小，解剖和生理特點更接近人類，抗感染力強，存活時間長，腦體積適宜。將SD大鼠自體血栓與0.9%的氯化鈉注射液的懸浮液輸入大腦中動脈，使大腦的中動脈支配區域形成的局灶性缺血性中風接近缺血性中風患者的臨床病理過程，能夠模擬臨床缺血性中風，適合于評價缺血性中風溶栓治療的療效。

1.2 制備血栓

SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，劑量為400 mg/kg，麻醉后分離頸動脈，取15 mL新鮮動脈血，按每10 μL 1份置于1.5 mL的EP管里，形成的血栓先室溫放置2 h，再于冰箱中－20℃放置22 h。使用時加0.5 mL 0.9%的氯化鈉注射液，用玻璃棒搗碎，制成大小均勻的血栓塊的0.9%的氯化鈉注射液懸浮液，通過顯微鏡觀察到每個血栓塊的體積大約為0.1 mm3。

1.3 缺血性中風大鼠模型制備及治療方案

雄性SD大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液，劑量為400 mg/kg，麻醉后于頸部正中縱行切口，分離出右側頸總動脈主干(約3 cm長)。于舌骨水平分離結扎頸外動脈各分支，于頸膨大處分離出頸內動脈。用無創動脈夾分別夾閉頸內動脈開口處和頸總動脈近心端，并結扎頸外動脈遠端。于頸外動脈主干處插入導管(導管內裝有0.5 mL血栓塊的0.9%的氯化鈉注射液懸浮液)，在松開頸內動脈夾的同時將導管內的血栓塊懸浮液緩慢從頸外動脈向近心端經過頸內動脈注入大腦中動脈。之后，結扎頸外動脈近心端，打開頸內動脈和頸總動脈處的動脈夾，恢復血流。或分離大頸外靜脈，把0.9%的氯化鈉注射液或藥物從頸外靜脈輸入，縫合傷口，肌肉注射2萬IU青霉素預防感染，得到缺血性中風大鼠立即1次性治療方案;或縫合傷口，肌肉注射2萬IU青霉素預防感染，4、6或24 h后把0.9%的氯化鈉注射液或陽性藥物(尿激酶和tPA)及治療藥物JXY(本實驗室合成的小分子多肽，成分為:Gly-Arg-Pro-Ala-Lys-Arg-Gly-Asp-Val)從尾靜脈輸入，得到缺血性中風4、6或24 h大鼠1次性治療方案;或者縫合傷口，肌肉注射2萬IU青霉素預防感染，4、6或24 h后把0.9%的氯化鈉注射液或藥物從尾靜脈輸入，每天1次，連續7 d，得到缺血性中風4、6或24 h大鼠連續治療方案。

1.4 缺血性中風大鼠的行為及療效

缺血性中風大鼠0.9%的氯化鈉注射液治療組，中風后立即治療組，中風4、6和24 h后治療組的大鼠蘇醒24 h后觀察其行為和療效。行為包括行走方式、右眼眼皮下垂程度、尾巴僵直程度、肌肉張力、腦袋偏斜程度、四肢支撐力和死亡數。行為改善程度，描述為可視性療效。立即接受一次性藥物治療的缺血性中風大鼠的行為與立即接受一次性0.9%的氯化鈉注射液治療的缺血性中風大鼠的行為比較，獲得可視性療效。連續接受藥物治療的缺血性中風大鼠每隔24 h從尾靜脈輸注一次藥物，第2天錄像，比較自身行為，獲得可視性療效;與0.9%的氯化鈉注射液治療大鼠比較眼眶、爪、鼻尖、尾部出血狀況，獲得可視性不良反應。解剖之后，在肺、脾、胃和腸部可發現明顯的出血狀況。按照1.3項的方法誘發的缺血性中風大鼠的行為可描述為6種損傷程度:①蘇醒之后24 h內死亡;②不能站立，尾巴僵直;③呈追尾狀行走，腦袋偏斜，左側前肢不能伸展，尾巴僵直;④呈追尾狀行走，左側前肢不能伸展，尾巴僵直;⑤轉圈狀行走，左側前肢不能伸展，尾巴僵直;⑥轉圈狀行走，右眼皮不能完全抬起，尾巴僵直。最終處死大鼠，取大腦，切片，測腦梗死體積。

2 結果

2.1 中風后立即接受一次性JXY治療的缺血性中風大鼠的行為

大鼠中風后立即接受一次性1 μmol/kg JXY治療的療效可依據給藥24 h后的行為判斷。0.9%的氯化鈉注射液為空白對照，20 000 IU/kg尿激酶和3 mg/kg tPA為陽性對照。為了定量比較療效，將上面提到的6種損傷變換為文獻常用的5個分值，5分為24 h內死亡，0分為無任何損傷癥狀，表示治愈，詳見表1。

大鼠中風后立即接受一次性0.9%的氯化鈉注射液，20 000 IU/kg尿激酶，3 mg/kg tPA 和1 μmol/kg JXY治療24 h后的行為(均未出現5分)為0分(治愈)的大鼠數分別為0%、10%、40%和60%;4分的大鼠數分別為10%、10%、10%和0%。0分和4分大鼠的數量說明1 μmol/kg JXY的療效比20 000 IU/kg尿激酶和3 mg/kg tPA好。

2.2 中風4、6、24 h后連續接受藥物治療的缺血性中風大鼠的行為

大鼠中風4、6、24 h后接受藥物治療24 h之后，每隔24 h給1次藥，分別連續給藥4、6、8 d。大鼠的行為通過錄像記錄，自身比較。療效可依據行為的改善來判斷。經過藥物連續治療后不能站立和尾巴僵直的大鼠的行為損傷逐步恢復，最后可直線行走，不遺留任何運動障礙。大鼠體質量逐日增加。大鼠中風4 h后接受1 μmol/kg JXY連續治療6次的結果，詳見表2。

表1 大鼠中風后立即接受JXY一次性治療的療效Tab.1 Efficacy of acute ischemic stroke rats immediately received one time treatment of JXY

表2 大鼠中風4 h后1 μmol/kg JXY連續治療6次的療效Tab.2 Efficacy of six times continuous treating by 1 μmol/kg JXY in acute ischemic stroke rats 4 h after symptom onset

大鼠中風4 h后接受6次1 μmol/kg JXY連續治療為0分(治愈)的大鼠數量從第1天的9%上升到第7天的73%，治愈率增高。

2.3 中風4 h后連續接受尿激酶和tPA治療的缺血性中風大鼠的行為

由于嚴重的出血不良反應，20 000 IU/kg尿激酶和3 mg/kg tPA的連續治療只允許2次，大鼠中風4 h后20 000 IU/kg尿激酶和3 mg/kg tPA連續治療2次的結果，詳見表3。大鼠中風4 h后接受2次20 000 IU/kg尿激酶連續治療為0分(治愈)和1分的大鼠均為0%，5分(死亡)的大鼠為33%。連續治療未提高治愈率。

大鼠中風4 h后接受2次3 mg/kg tPA連續治療0分(治愈)的大鼠為0%。5分(死亡)的大鼠為17%。連續治療可稍稍改善療效，詳見表3。

2.4 中風后JXY及tPA治療的缺血性中風大鼠的腦切片

對中風4 h后接受1次1 μmol/kg JXY和3 mg/kg tPA治療的大鼠，取大腦，切片。灰白色表示腦梗區，紅色表示正常區(圖1)。3 mg/kg tPA治療的大鼠腦切片有明顯灰白色的腦梗區(圖1A)。1 μmol/kg JXY治療的大鼠腦切片全部是紅色正常區(圖1B)。可見，1 μmol/kg JXY的療效明顯強于3 mg/kg tPA。

圖1 TTC染色的大鼠腦切片Fig.1 Coronal slice of rats stained with TTC

表3 大鼠中風4 h后20 000 IU/kg尿激酶或3 mg/kg tPA連續治療2次的療效Tab.3 Efficacy of two times continuous treating by 20 000 IU/kg urokinase or 3 mg/kg tPA in acute ischemic stroke rats 4 h after symptom onset

2.5 藥物的出血不良反應

接受尿激酶或tPA連續治療3 d的中風大鼠可以看到眼眶、爪、鼻尖、尾部出血。在肺、脾、胃和腸部可看到明顯的出血狀況。大鼠無出血不良反應(圖2)。tPA連續治療3d，大鼠眼眶、爪、鼻和尾部都看到出血(圖3)。tPA連續治療3 d出血致死大鼠的肺、脾、胃和腸部可看到明顯出血狀況(圖4)。

圖2 無出血不良反應的大鼠Fig.2 Rats without bleeding side effects

圖3 tPA連續治療3d眼眶、爪、鼻和尾部都看到出血的大鼠Fig.3 Bleeding occurs in eyes，paw，nose and tail in rats treated with tPA for 3 consecutive days tPA:tissue plasminogenactivator.

圖4 tPA連續治療3d出血致死大鼠的肺、脾、胃和腸部可看到明顯出血狀況Fig.4 Significant bleeding occurs in lung，spleen，stomach and enteron in dead rats treated with tPA for 3 consecutive days tPA:tissue plasminogenactivator.

3 討論

突破6 h黃金治療時間(即中風6 h后療效確切)和避免出血不良反應是缺血性中風臨床治療藥物研究的2個瓶頸。建立缺血性中風時間長的大鼠模型，是突破第1個瓶頸的基礎條件。評價標準實用化是突破第2個瓶頸的基礎條件。文獻［11-13］報道的大鼠模型缺血性中風時間最長為60 min和75 min，本研究的大鼠模型把缺血性中風時間延長至4、6、24 h。本研究將大鼠的行為細致分類，使缺血性中風大鼠的癥狀容易描述，療效容易比較。分析缺血性中風大鼠的行為與病情，行為與療效，療程與療效，以及行為與不良反應的關聯性，使得藥物的安全性和有效性可合理地用行為描述。對中風4、6、24 h的大鼠分別進行4、6和8 d連續治療，使得藥物的安全性和有效性可合理體現。療效治療還發現，大鼠在行為損傷逐步好轉期間身體非常虛弱，無自主飲水和進食能力，體質量快速下降。行為損傷基本消失的大鼠因饑渴可突然死亡，例如大鼠中風4 h后接受6次1 μmol/kg JXY連續治療的第2天就出現了1例死亡。針對缺血性中風使大鼠喪失自主飲水和進食能力，在連續治療期間采取護理措施，使得患病大鼠的體質不干擾藥物的療效。用大鼠自身行為能力改善評價藥物療效，避免了分組打分時，組間比較給療效描述帶來的模糊性。大鼠中風4、6或24 h后連續治療4、6和8 d，實際包含了缺血性中風大鼠定時模型和藥物治療策略兩個要素。本研究結果顯示，JXY對中風4、6或24 h大鼠的確切療效映射了其在臨床的應用價值。

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