響應面法對煙草中非揮發性有機酸含量測定的優化

邱寶平+王政+劉曉旭+郭連民+祁林+郭鵬+陳亮+張峻松

摘要：采用響應面法（RSM）對甲酯化試驗條件進行優化， 研究甲酯化條件對煙草中非揮發性有機酸含量測定的影響。根據Box-Behnken Design設計原理，以非揮發性有機酸測定量為指標，考察了H2SO4-CH3OH溶液體積分數、反應溫度、反應時間和料液比等條件對非揮發性有機酸測定量的影響。結果表明，煙草中非揮發性有機酸的最優試驗條件為：H2SO4-CH3OH溶液體積分數為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時間為3.0 h、料液比為1∶43。在最優的條件下進行了5次驗證試驗，得到的非揮發性有機酸總量平均值為182.32 mg/g，相對標準偏差為0.92%。

關鍵詞： 煙草；非揮發性有機酸；響應面法；測定

中圖分類號：O657.7+1；S572 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）15-3629-05

Optimizing the Determination of Non-volatile Organic Acids in Tobacco with

Response Surface Methodology

QIU Bao-ping1，WANG Zheng2，LIU Xiao-xu1，GUO Lian-min1，QI Lin2，GUO Peng1，CHEN Liang1，ZHANG Jun-song2

（1.Hongta Liaoning Tobacco Co.， Ltd.，Shenyang 110002，China；2.Zhengzhou University of Light Industry， Zhengzhou 450002， China）

Abstract： To study effects of the determination on non-volatile organic acids in tobacco， response surface methodology（RSM） was used to optimize of the conditions of methylated. Box-Behnken Design was used to design the experiments. The value of non-volatile organic acids was used as a response value. The concentration of H2SO4-CH3OH solution， reaction temperature and time， ratio of liquid to solid were selected as causal factors. The results showed that the best conditions were H2SO4-CH3OH of 12.0%， the temperature of water bath of 92.0 ℃， the time of reflow of 3.0 h， the solid to liquid ratio of 1∶43. Five validation experiments were carried out under these optimal conditions， the average value of total content of non-volatile organic acid was 182.32 mg/g. The relative standard deviation was 0.92%.

Key words： tobacco； non-volatile organic acid； response surface methodology； determination

收稿日期：2013-09-06

作者簡介：邱寶平（1973—），男，遼寧鐵嶺人，工程師，主要從事卷煙產品配方與質量控制研究；通訊作者，張峻松，教授，碩士生導師，

主要從事煙草方面教學與科研工作，（電話）0371-63670231（電子信箱）13283712413@163.com。

煙草中非揮發性有機酸主要包括多元酸和高級脂肪酸，占煙葉重量的10%左右，可調節煙葉自身的酸堿度，影響煙葉的勁頭和吃味，起到平衡煙氣的作用，也能影響煙氣的香氣[1，2]。國內已有關于酯化試驗單因素對煙草中非揮發性有機酸測定結果影響的相關報道[3-5]，但未見采用響應面法優化設計煙草非揮發性有機酸的測定條件。響應面法（RSM）根據Box-Behnken Design（BBD）設計的試驗結果進行二次多元回歸擬合，分析因素與響應值的關系，達到優化試驗條件的目的[6-8]，該方法已廣泛應用于化學、生物、食品等領域。本研究以煙草中非揮發性有機酸總量為指標，采用響應面法優化煙草非揮發性有機酸的測定條件，以期為卷煙工業的加工利用提供科學的參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

煙葉由紅塔遼寧煙草有限責任公司提供。

硫酸（優級純，天津市四友精細化學品有限公司）；甲醇（色譜純，天津市四友精細化學品有限公司）；己二酸二甲酯、草酸二甲酯、丙二酸二甲酯、丁二酸二甲酯、正十三碳酸甲酯、蘋果酸二甲酯、硬脂酸甲酯、正十五碳酸甲酯、月桂酸甲酯、檸檬酸甲酯 （分析純，中國醫藥集團上?；瘜W試劑公司）；棕櫚酸甲酯、油酸甲酯、亞油酸甲酯、亞麻酸甲酯（百靈威科技有限公司）；二氯甲烷、無水硫酸鈉、氯化鈉（分析純，天津德恩化學試劑有限公司）。

EL204型電子天平（梅特勒-托利多上海有限公司）；7820A型氣相色譜儀（美國安捷倫公司）；HH-4型數顯恒溫水浴鍋（金壇市科學儀器有限公司）。endprint

1.2 方法

1.2.1 煙葉樣品的制備 按照我國煙草行業標準[9]制備煙葉樣品及測定其含水率。將煙葉用粉碎機粉碎，過40目篩后置于棕色廣口瓶中保存，用烘箱法測定含水率。

1.2.2 H2SO4-CH3OH溶液 在冰水浴攪拌的條件下，將適量濃硫酸緩慢加入一定量的無水甲醇中，攪拌均勻配置成不同體積分數的H2SO4-CH3OH溶液。

1.2.3 內標溶液 稱量1.493 1 g己二酸二甲酯于250 mL的容量瓶中，加入甲醇稀釋至刻度，即得到濃度為5.972 mg/mL的內標溶液（0 ℃冰箱內可保存1個月）。

1.2.4 煙葉樣品的甲酯化 準確稱取1.000 0 g樣品，置于100 mL平底燒瓶中，加入一定體積的硫酸-甲醇溶液，再加入1 mL己二酸內標溶，水浴加熱，取回流液10 mL于125 mL分液漏斗中，加入20 mL飽和氯化鈉溶液，每次用10 mL二氯甲烷萃取，合并萃取液，加入3.0 g無水硫酸鈉干燥過夜。采用氣相色譜法進行測定。

1.3 氣相色譜分析條件

氣相色譜條件：色譜柱為HP-INNOWAX（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；載氣為氦氣；柱流速1.2 mL/min （恒流模式）；平均線速度29.134 cm/sec；進樣口溫度280 ℃；分流比為5∶1；程序升溫，色譜柱初始溫度50 ℃（保持2 min），以4 ℃/min升溫至220 ℃（保持20 min）；進樣量為1.0 μL 。

檢測器為FID；檢測器溫度為280 ℃；氫氣為40 mL/min；空氣為450 mL/min；尾吹氣為20 mL/min。

1.4 非揮發性有機酸定性、定量方法

與標準樣品相對保留時間比較，對各非揮發性有機酸定性，采用內標法定量。

2 結果與分析

2.1 工作曲線

稱取適量非揮發性有機酸甲酯標準樣品于50 mL容量瓶中，加入甲醇定容至刻度，配制7個梯度的標準溶液進行氣相色譜分析，并對各標準樣品與內標的峰面積之比與相應標樣的質量進行回歸分析。得到各非揮發性有機酸甲酯線性方程及相關系數，各成分的相關系數為0.997～0.999，表明工作曲線線性關系良好，適用于非揮發性有機酸的定量分析。

2.2 甲酯化反應的單因素試驗

2.2.1 不同體積分數的H2SO4-CH3OH溶液對測定結果的影響 保持其他因素不變，分別使用2%、4%、6%、8%、10%、12%、15%的H2SO4-CH3OH溶液進行考察，結果如圖1所示。

由圖1可知，隨著H2SO4-CH3OH溶液體積分數的增加，非揮發性有機酸總量也增加，當濃度達到10%時非揮發性有機酸總量最大，之后有所下降。主要原因是在高濃度硫酸環境中，非揮發性有機酸會發生脫水和氧化反應，導致測定結果偏低。

2.2.2 料液比對測定結果的影響 保持其他因素不變，分別使用25、30、35、40、45、50和55 mL 12%的H2SO4-CH3OH溶液進行試驗，結果如圖2所示。

由圖2可知，隨著H2SO4-CH3OH溶液體積的增加，非揮發性有機酸總量測定值也隨之增加，當料液比達到1∶45時，非揮發性有機酸總量的測定值最大，所以較合適的料液比為1∶45。

2.2.3 水浴溫度對測定結果的影響 保持其他因素不變，分別取水浴溫度60、70、80、90、100 ℃進行試驗，結果如圖3所示。

由圖3可知，隨著水浴溫度的升高，非揮發性有機酸的測定值也增加，當溫度達到90 ℃時測定值接近達到最大，之后非揮發性有機酸的總量有所下降。主要原因是隨著溫度的增加加快了酯化反應，但是溫度過高會導致衍生物揮發和分解，導致測定結果偏低， 選取最佳水溶液溫度為92 ℃。

2.2.4 回流時間對測定結果的影響 保持其他因素不變，分別選取1.0、1.5、2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 h進行試驗，結果如圖4所示。

由圖4所知，隨著回流時間的增加，非揮發性有機酸的測定值也增加，當達到3 h時測定值達到最大，之后非揮發性有機酸的總量有所下降。主要原因是因為反應時間過長高級脂肪酸會破壞，導致測定值偏低。

2.2.5 CH2Cl2萃取次數對測定結果的影響 保持其他因素不變，對回流液用CH2Cl2萃取1、2、3、4、5、6次，結果如圖5所示。

由圖5可知，隨著萃取次數的增加，非揮發性有機酸的測定值也增加，甲酯化衍生物得到充分萃取，當萃取5次時測定值最大，之后非揮發性有機酸的總量有所下降。因此以下試驗使用CH2Cl2萃取5次。

2.3 響應面分析法優化工藝條件

2.3.1 響應面分析方案與試驗結果 根據單因素試驗的結果，以A-H2SO4-CH3OH溶液的體積分數、B-料液比、C-水浴溫度、D-回流時間為考察因素，采用Design-Expert軟件為輔助手段設計響應面試驗，響應面各因素及水平如表1所示，采用Box-Behnken 設計進行了29組試驗。

2.3.2 方差分析和二元回歸方程擬合 采用Design-Expert軟件對29組試驗結果進行二次多元回歸擬合，得到非揮發性有機酸的測定值的編碼自變量A、B、C、D的二次多項式回歸方程：R=196.87+2.81A+2.18B+2.83C+3.21D+0.21AB-0.44AC-0.23AD+0.17BC+0.45BD-4.85CD-1.30A2-8.46B2-5.04C2-2.51D2

對上述回歸模型進行方差分析，結果見表2。

由表2可知，模型F值為4.33，概率P<0.05，表示該模型是顯著的，非揮發性有機酸測定值與所選因素之間存在顯著相關性，回歸模型的決定系數（R2=0.812 3）即由這4個因素及其二次項決定， 而失擬項F值為0.77，概率P>0.05，失擬項不顯著，說明未知因素對試驗結果干擾很小，表示回歸方程在整個回歸區域的擬合情況良好。4個因素對響應值影響大小順序為：回流時間>水浴溫度>H2SO4-CH3OH溶液體積分數>料液比。回歸模型中A2、B2、C2對非揮發性有機酸的測定值影響是顯著的（P<0.05）。endprint

2.3.3 交互作用分析 對影響因素的響應面圖和等高線圖進行分析，更直觀的表現兩個因素同時對非揮發性有機酸測定值的影響。如圖6至圖8。

由圖6、圖8可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的濃度和料液比）、BD（料液比和回流時間）、CD（水浴溫度和回流時間）的等高線圖成橢圓形，表明交互作用對響應值有影響[10]。由圖6、圖7可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的體積分數和料液比）、BD（料液比和回流時間）的交互作用不明顯。

對模型響應面規范分析，結合試驗的可操作性，得到非揮發性有機酸測定的最優條件：H2SO4-CH3OH溶液的體積分數為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時間為3.0 h、料液比為1∶43。

2.3.4 最佳條件的驗證試驗 為了進一步驗證模型的可靠性，對最優條件進行5次試驗，非揮發性有機酸測定值平均值為182.32 mg/g，試驗方法的相對標準偏差為0.92%。因此，利用響應面分析法得到非揮發性有機酸的最佳測定工藝條件是真實可靠的。

3 結論

利用響應面回歸分析法，對測定非揮發性有機酸的試驗條件進行優化。以非揮發性有機酸的測定值為指標，對二次多遠回歸模型的方差分析，考察了H2SO4-CH3OH溶液的體積分數、料液比、水浴溫度、回流時間等試驗條件對非揮發性有機酸總量測定值的影響。

對模型響應面規范分析，結合試驗的可操作性，得到非揮發性有機酸測定的最優條件：H2SO4-CH3OH溶液的體積分數為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時間為3.0 h、料液比為1∶43。

參考文獻：

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[11] 王 濤， 賀 帆， 田斌強， 等. 烤煙煙葉淀粉的提取工藝優化[J]. 煙草科技， 2012 （6）： 80-83.endprint

2.3.3 交互作用分析 對影響因素的響應面圖和等高線圖進行分析，更直觀的表現兩個因素同時對非揮發性有機酸測定值的影響。如圖6至圖8。

由圖6、圖8可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的濃度和料液比）、BD（料液比和回流時間）、CD（水浴溫度和回流時間）的等高線圖成橢圓形，表明交互作用對響應值有影響[10]。由圖6、圖7可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的體積分數和料液比）、BD（料液比和回流時間）的交互作用不明顯。

對模型響應面規范分析，結合試驗的可操作性，得到非揮發性有機酸測定的最優條件：H2SO4-CH3OH溶液的體積分數為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時間為3.0 h、料液比為1∶43。

2.3.4 最佳條件的驗證試驗 為了進一步驗證模型的可靠性，對最優條件進行5次試驗，非揮發性有機酸測定值平均值為182.32 mg/g，試驗方法的相對標準偏差為0.92%。因此，利用響應面分析法得到非揮發性有機酸的最佳測定工藝條件是真實可靠的。

3 結論

利用響應面回歸分析法，對測定非揮發性有機酸的試驗條件進行優化。以非揮發性有機酸的測定值為指標，對二次多遠回歸模型的方差分析，考察了H2SO4-CH3OH溶液的體積分數、料液比、水浴溫度、回流時間等試驗條件對非揮發性有機酸總量測定值的影響。

對模型響應面規范分析，結合試驗的可操作性，得到非揮發性有機酸測定的最優條件：H2SO4-CH3OH溶液的體積分數為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時間為3.0 h、料液比為1∶43。

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2.3.3 交互作用分析 對影響因素的響應面圖和等高線圖進行分析，更直觀的表現兩個因素同時對非揮發性有機酸測定值的影響。如圖6至圖8。

由圖6、圖8可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的濃度和料液比）、BD（料液比和回流時間）、CD（水浴溫度和回流時間）的等高線圖成橢圓形，表明交互作用對響應值有影響[10]。由圖6、圖7可知，AB（H2SO4-CH3OH溶液的體積分數和料液比）、BD（料液比和回流時間）的交互作用不明顯。

對模型響應面規范分析，結合試驗的可操作性，得到非揮發性有機酸測定的最優條件：H2SO4-CH3OH溶液的體積分數為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時間為3.0 h、料液比為1∶43。

2.3.4 最佳條件的驗證試驗 為了進一步驗證模型的可靠性，對最優條件進行5次試驗，非揮發性有機酸測定值平均值為182.32 mg/g，試驗方法的相對標準偏差為0.92%。因此，利用響應面分析法得到非揮發性有機酸的最佳測定工藝條件是真實可靠的。

3 結論

利用響應面回歸分析法，對測定非揮發性有機酸的試驗條件進行優化。以非揮發性有機酸的測定值為指標，對二次多遠回歸模型的方差分析，考察了H2SO4-CH3OH溶液的體積分數、料液比、水浴溫度、回流時間等試驗條件對非揮發性有機酸總量測定值的影響。

對模型響應面規范分析，結合試驗的可操作性，得到非揮發性有機酸測定的最優條件：H2SO4-CH3OH溶液的體積分數為12.0%、水浴溫度為92 ℃、回流時間為3.0 h、料液比為1∶43。

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[11] 王 濤， 賀 帆， 田斌強， 等. 烤煙煙葉淀粉的提取工藝優化[J]. 煙草科技， 2012 （6）： 80-83.endprint