重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白注射液治療慢性乙型肝炎受試者后血清中和抗體檢測

首都醫科大學附屬北京佑安醫院（100069）賈敏 王立清 段瑾 陳曦 盛艾娟 王美霞

北京杰華生物技術有限責任公司（100102）呂秋軍 徐靜 王寶亮 梁屹

重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白注射液（樂復能）是由北京杰華生物技術有限責任公司自主研發成功，系采用基因穿梭法，從12種人α干擾素基因構建雜交文庫，采用高通量篩選技術，篩選10多萬個克隆而得到的高活性新型蛋白，由498個核苷酸編碼、166個氨基酸組成，分子量為19.3kD，已經取得美國專利。樂復能在臨床上準備開發用于治療慢性乙型肝炎（CHB），2009年獲得SFDA新藥臨床研究批件，于2010年3月正式啟動試驗，2011年11月完成所有受試者的治療與隨訪觀察。

該臨床試驗設計成3組，共入組24例受試者。研究性治療期：6周～7周。第1組“第1日，10μg/次，1次/日；第2～7日，停藥；第2周～第7周，10μg/次，1次/日；入組8例受試者，脫落1例”；第2組“第1～6周，10μg/次，每周3次（隔日1次）；入組6例受試者”；第3組“第1周，10μg/次，1次/日；第2～6周，20μg/次，每周3次（隔日1次）；入組10例受試者”。各劑量組給藥途徑均為肌肉注射。

近年來，隨著大量生物技術藥物的研發，免疫原性的評價成為闡明這些藥物臨床安全性和有效性的關鍵因素[1]。中和抗體的活性是免疫原性的重要評價指標，會中和藥物的活性，影響藥物的清除、血漿半衰期和組織分布，改變藥效/藥動學，使在非臨床研究中觀察到的效應，可能并非藥物真正的藥理和/或毒性反應，因此在評價藥物安全性時同時考察中和抗體活性非常必要。世界衛生組織從1983年[2][3][4]開始推薦使用 Kawade 等人[5][6][7]創立的細胞病變效應實驗作為檢測α、β干擾素中和抗體的方法，此法目前廣泛采用。這次樂復能乙肝臨床試驗血清樣品檢測即遵循Kawada創立的細胞病變效應（Cytopathic effect）方法，即10倍減少單位（Tenfold reduction Unit， TRU）中和滴度法。

1 材料

1.1 試驗用藥 重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白注射液(北京四環生物制藥有限公司，規格2 0μg·m l-1，批號20090601/20100101/20110303)；重組高效抗腫瘤抗病毒蛋白注射液原液（北京杰華生物技術有限責任公司，蛋白含量1.08mg·mL-1，批號01/P101206）。

1.2 樣品 待檢樣品（樂復能臨床試驗佑安醫院受試者43天或50天抗藥抗體陽性血清）；陰性對照血清（本實驗室2位志愿者的血清）。

1.3 試劑與耗材 WISH細胞（購自中國藥品生物制品檢定所，液氮保存）；V S V水泡性口炎病毒（購自中國藥品生物制品檢定所，液氮保存）；MEM培養基（GIBCO，Cat.No. 41500-034，2℃～8℃保存）；Penstrep（GIBCO，Cat.No. 15140-122，2℃～8℃保存）；0.25%Trypsin-EDTA（GIBCO，Cat.No.25200-056，2℃～8℃保存）；FBS胎牛血清（GIBCO，Cat.No. 10099-141，-20℃保存）；NaHCO3（Sigma，Cat. No. S7795-500G）；結晶紫（崇明縣裕西試劑廠）；無水乙醇（北京化工廠）；醋酸（北京化工廠）；單條可拆酶標板（Nunc，Cat.No.468667）；96孔U型細胞培養板(Nunc，Cat.No. 163320)。

1.4 儀器 酶標儀（VERSAmax，美國Molecular Devices）；水浴鍋（北京市醫療設備廠，型號 GSY-Ⅱ）；旋渦混勻器（德國IKA，型號 VG3 S25）；超凈工作臺（蘇凈安泰，SW-CJ-ZFD）；倒置顯微鏡（重慶光學儀器廠，XDS-1B）；CO2培養箱（日本SANYO，MCO-15AC）；12道移液器（美國eppendorf，型號 30～300μl）。

2 方法與結果

2.1 第1天 細胞制備

2.1.1 將WISH細胞，用0.25%Trypsin-EDTA消化后加入完全培養液吹均勻，制成濃度為1.8～2.2×105個·ml-1的單細胞懸液，加入96孔細胞培養板中，每孔0.1ml，5% CO2，37℃，培養18～24小時。

2.1.2 將待檢血清56℃ 30分鐘滅活（水浴），備用。

2.2 第2天 樣品稀釋

2.2.1 待檢樣品 在稀釋板上用樣品稀釋液（含10 LU·ml-1樂復能的完全培養基。根據Kawade法，如果多于或者少于10倍實驗室單位，均有可能造成最終結果的偏差；在多次預實驗中，樂復能在本實驗中的實驗室單位（LU）是2pg·ml-1。）稀釋滅活后的待檢血清用樣品，從1∶20 起始，然后依次對倍稀釋至1∶640，共6個稀釋度，每個稀釋度的血清均含20pg·ml-1的樂復能。每稀釋度做復孔，然后將稀釋好的血清樣品加入第一天鋪有WISHⅠ細胞的細胞培養板中，每孔加入100μl。

2.2.2 標準品 取自制樂復能原液，再用完全培養液將樂復能稀釋至15 pg·ml-1；然后依次對倍稀釋至0.47 pg·ml-1，共6 個稀釋度，每塊細胞板中加入一組標準品稀釋液，每個稀釋度2孔，每孔100μl。

2.2.3 細胞對照 將陰性血清1∶20 稀釋，每塊細胞板中加入3個孔，每孔 100μl。

以上2.1至2.3操作完畢后，將細胞板置CO2孵箱（5% CO2，37℃）中，培養18～24小時。

2.3 第3天 攻毒

2.3.1 病毒液的配制 從毒種庫中取出水泡性口炎病毒（VSV，-70℃保存），加入細胞攻毒液，配成100 CCID50的病毒攻擊液備用。

2.3.2 取出細胞培養板，棄去板中液體并拍干，加入制備的病毒液每孔100μl，3個細胞對照孔加入完全培養基，余加入細胞攻毒培養液。

2.3.3 培養 將細胞板置CO2孵箱（5%CO2，37℃）中，培養18～24小時。

2.4 第4天 終止

鏡檢標準品孔5 0%病變點約在2 pg·ml-1。然后棄去細胞培養板中的上清液，每孔加入染色液 50μl置30分鐘后，用流水小心沖去染色液，待板晾干后每孔加入脫色液100μl，混勻后，用酶標儀以630nm為參比波長，570nm為測定波長，檢測吸光度，記錄測定結果。

2.5 陽性血清樣本中和抗體活性結果

前期研究發現23例受試者出組時(給藥后第50天或第43天)，除1#受試者外均產生了抗藥抗體，但中和抗體活性結果檢出率為0%，結果如附表所示。

3 討論

干擾素抗體的發生率因干擾素種類的不同有差異，目前認為基因重組α干擾素的抗體出現率明顯高于天然α干擾素(人白細胞干擾素或人類淋巴母細胞干擾素) ，臨床上應用的IFN-α有IFN-α2a、IFNα2b、IFN-αl三種，一般認為IFN-α2a產生抗體的陽性率及效價最高，IFN-α2b次之，IFN-α1最低，其中，INF-α2a的抗體產生率為20%～40%，INF-α2b的抗體產生率為6.9%～40%，INF-αNl為 0.97%[8][9][10]。干擾素抗體可根據是否中和干擾素的生物學活性分為兩種：一種為中和抗體(NA)，可與干擾素的生物學活性位點結合，中和干擾素活性，降低血清干擾素水平，從而使干擾素失去生物學活性；另一種為結合抗體(BA)，當它與干擾素結合時，不影響干擾素的生物學活性。劉勁陽等[11]， 陳憲銳等[12]多篇研究中均報道中和抗體的出現與干擾素治療失敗顯著相關，中和抗體是影響干擾素治療療效的重要因素之一。本研究中樂復能應用于患者后，抗藥抗體產生率接近100%，但卻沒有中和抗體活性。初步推測樂復能中和抗體的產生率低于普通干擾素，需要后期臨床試驗加大受試者例數來確證。由于干擾素臨床適應癥廣泛，療效確切，國內臨床需求量大，國外進口藥品價格昂貴等諸多因素，干擾素類新藥物的研發刻不容緩。

附表 佑安醫院受試者（抗體陽性）血清樣本結束給藥時抗體滴度和中和抗體活性