新型抗癲癇藥瑞替加濱的遺傳毒性雜質的控制

天津市漢康醫藥生物技術有限公司(300203)刁榮蓉 劉立明 張曼 孫影倩 侯俊

關鍵字：瑞替加濱；液相色譜-串聯質譜法；遺傳毒性雜質

瑞替加濱是一種口服起效的鉀離子通道開放劑，由葛蘭素史克和Valeant制藥公司共同研發生產。于2011年3月經EMEA批準在歐洲上市，商品名：Trobalt?；于2011年6月經FDA批準在美國上市，商品名為Potiga?。適用于18歲及以上成人癲癇部分性發作的輔助治療。

本品是一種具有新作用機制的抗癲癇藥。研究證實，瑞替加濱的作用與電壓門控型鉀離子通道（KCNQs）有關，其中作用于KCNQ2/3通道調節M型鉀電流（[Ik（M）]）是其主要的作用機制[1][2][3]。瑞替加濱的抗癇機制決定了其作用特點有別于其他抗癲癇藥物，這不是作用于神經元的N -甲基- D-天冬氨酸（NMDA），亦不能阻斷神經元鈉離子電流的內向鉀電流和混合性鈣離子電流，而是通過激活γ-氨基丁酸（GABA）[4]誘導的電流而起作用。

根據EMEA公布的遺傳毒性雜質的警示結構，瑞替加濱具有苯胺基結構，原研廠家對本品進行了小鼠骨髓的微核實驗以及大鼠肝細胞的體內/體外UDS實驗，結果顯示為陰性，在非臨床研究的Ames試驗中，研究顯示當雜質含量降低到限度閾值以下時，Ames試驗則顯示為陰性，因此瑞替加濱無遺傳毒性，但通過研究發現，本品在合成過程中也涉及苯胺基結構的雜質，為了將其控制在限度閾值以下，我們進行了研究。

附圖1 乙基（4-{[4-氟苯基）甲基]氨基}-2-硝基苯基)氨基

附圖2 乙基（4-{[(1E)-(4-氟苯基)亞甲基]氨基}-2-硝基苯基）氨基

1 根據合成工藝分析，本品中可能含有如下遺傳毒性雜質

1.1 雜質1 乙基（4-{[4-氟苯基）甲基]氨基}-2-硝基苯基)氨基，見附圖1。

1.2 雜質2 乙基（4-{[(1E)-(4-氟苯基)亞甲基]氨基}-2-硝基苯基）氨基，見附圖2。

附圖3 雜質線性試驗

1.3 上述雜質由于其含有苯胺基結構而可能具有遺傳毒性，因此按照EMEA《遺傳毒性雜質限度指導原則》要求，瑞替加濱最大日劑量為1.2g/天，毒理學擔憂閾值(TTC)為1.5μg/天，故本品遺傳毒性雜質的雜質限度應為(1.5μg/天)/(1.2g/天)=1.25ppm，因此我公司制定了遺傳毒性雜質的檢測方法，已將其控制在該限度一下。

2 測定方法

2.1 儀器 安捷倫G6410A 三重四級桿液質聯用儀。

2.2 質譜條件

①檢測方式：正離子檢測方式；②離子源：電噴霧離子化源；③離子源噴射電壓：4.0kV；④毛細管溫度 (℃)：325；⑤輔助氣流速： 45；⑥掃描方式：一級全掃描方式，二級全掃描方式；⑦色譜柱：Waters RP18 5μm， 4.6 x 150mm Column。

附表1 線性試驗結果

附表2 雜質2回收率試驗結果

附表3 雜質2回收率試驗結果

附表4 液相梯度

2.3 液相梯度 見附表4。

3 試驗

3.1 定位試驗 精密稱取瑞替加濱與雜質1、2適量，配制雜質混合溶液，注入液相色譜儀，進行LC-MS/MS試驗[5]，由混合溶液圖譜可知，各通道均可良好檢出，瑞替加濱主峰保留時間為6.3min，兩雜質1、2的保留時間分別為7.4min和8.3min，主成分與雜質峰分離良好。

3.2 線性試驗 精密稱取雜質1、2各10mg，置同一100ml量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為儲備溶液，精密量取儲備溶液，加乙腈稀釋制成每1ml中約含上述雜質2ng、4ng、6ng、8ng、10ng的溶液，作為溶液①、②、③、④、⑤，分別精密量取上述溶液各5μl注入液相色譜儀，進行LC-MS/MS試驗，記錄色譜圖，見附圖3，附表1。由以上試驗可知，上述雜質在濃度在0～10ng/ml中線性關系良好。

3.3 檢測限試驗 取定量限溶液3ml，置10ml量瓶中，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，精密量取5μl注入液相色譜儀，進行LCMS/MS試驗，記錄色譜圖。各雜質檢測限濃度均為0.6ng/ml。相當于0.2ppm的雜質可檢出。

3.4 回收試驗 精密量取儲備溶液適量，加乙腈溶解并稀釋制成每1ml中約含雜質1、2 各32、40、48ng的溶液，作為儲備溶液，平均制備三份，精密量取1ml，置10ml量瓶，分別加入瑞替加濱32mg，加乙腈稀釋至刻度，搖勻，作為供試品溶液，分別精密量取5μl，注入液相色譜儀，進行LC-MS/MS試驗，以測得量/添加量×100%計算回收率，結果各雜質回收率良好。見附表2，3。

4 結論

該方法測定瑞替加濱的遺傳毒性雜質可行，且經檢測本品中雜質1、2均未檢出，說明我公司合成的原料藥遺傳毒性雜質符合限度要求。