高效液相色譜法測(cè)定防風(fēng)中色原酮的含量

北京醫(yī)藥集團(tuán)職工大學(xué)（100079）項(xiàng)瑞

防風(fēng)為傘形科植物防風(fēng) Saposhnikovia divaricata（Turcz.）Schischk 未抽花莖的干燥根，春、秋二季采挖未抽花莖植株的根，除去泥沙及須根，曬干。主產(chǎn)地為黑龍江、吉林、河北、遼寧等地。始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為上品，辛、甘，微溫，歸肝、脾、膀胱經(jīng)，具有解表散風(fēng)、祛風(fēng)止痙及勝濕止痛等功效，主治周身盡痛、外感風(fēng)寒、頭痛目眩、風(fēng)寒濕痹，骨節(jié)疼痛、四肢攣急等證，是中藥復(fù)方的重要組成之一，廣泛應(yīng)用于中醫(yī)臨床。防風(fēng)中主要化學(xué)成分主要是色原酮類，揮發(fā)性成分，香豆素類，多糖等。高效液相色譜法準(zhǔn)確、可靠，操作簡(jiǎn)便，可有效應(yīng)用于防風(fēng)的質(zhì)量控制[1][2]。

1 儀器與試劑

島津LC-20A高效液相色譜儀（島津國(guó)際貿(mào)易（上海）有限公司）；色譜柱：Diamonsil（R）鉆石C18（250mm×4.6mm），5μm；KQ3200DE數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。BS-110S電子天平（北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司），AE240METTLER（梅特勒-托利多）。

升麻素苷對(duì)照品（批號(hào)111522～200406）、5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品（批號(hào)111523～200405），均購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，純度供含量測(cè)定用。防風(fēng)飲片購(gòu)自安國(guó)市藥材市場(chǎng)（經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)陳玉婷老師鑒定為防風(fēng)正品），乙腈為色譜純（Fisher Scientific），純凈水（杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司），其他試劑均為分析純（北京北化精細(xì)化學(xué)品有限責(zé)任公司）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil 鉆石C18（250mm×4.6mm），5μm；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸(18∶82)；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；流速：1mL/min。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品HPLC色譜圖見(jiàn)附圖1～3。

附圖1 升麻素苷標(biāo)準(zhǔn)品

附圖2 5-O-甲基維斯阿米醇苷標(biāo)準(zhǔn)品

附圖3 防風(fēng)細(xì)粉HPLC色譜圖

附圖4 升麻素苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

附圖5 5-O-甲基維斯阿米醇苷標(biāo)準(zhǔn)曲線

附表1 升麻素苷線性關(guān)系考察

附表2 5-O-甲基維斯阿米醇苷線性關(guān)系考察

附表3 精密度實(shí)驗(yàn)

附表4 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)

附表5 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取升麻素苷對(duì)照品1.42mg，5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品1.76mg，分別加甲醇溶解至25mL量瓶中，定容并搖勻，制成含升麻素苷0.0568mg/mL的對(duì)照品溶液，含5-O-甲基維斯阿米醇苷0.0704mg/mL對(duì)照品溶液，備用。

2.2.2 供試品溶液 取本品細(xì)粉約0.2克，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20mL，稱定重量，超聲40min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備 分別精密吸取升麻素苷（0.0568mg/mL）對(duì)照品溶液、5-O-甲基維斯阿米醇苷（0.0704mg/mL）對(duì)照品溶液 0.2、5、10、15、20μL，按上述色譜條件測(cè)定峰面積。以色譜峰峰面積為縱坐標(biāo)，分別以升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的量為橫坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，其回歸方程分別為：Y=1760119.1248X+7637.3464，r=0.9998；Y=2059780.5679X-2149.6618，r=0.9999可見(jiàn)，升麻素苷在0.01136～1.136μg范圍內(nèi)，5-O-甲基維斯阿米醇苷在0.01408～1.408μg具有良好的線性關(guān)系。見(jiàn)附表1～3；附圖4，5。

2.4 方法學(xué)考察

2.4.1 精密度實(shí)驗(yàn) 制備同一供試品溶液，連續(xù)進(jìn)樣5次，升麻素苷峰面積RSD＝0.05%，5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積RSD=0.78%，見(jiàn)附表3。結(jié)論顯示儀器精密度良好。

附表6 升麻素苷加樣回收率表

2.4.2 重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 取細(xì)粉約0.2克，精密稱定，置50mL具塞錐形瓶中，精密加入甲醇20mL，稱定重量，超聲40min，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。平行5份測(cè)定，RSD分別為2.73%、0.80%，結(jié)果見(jiàn)附表4。顯示該方法重復(fù)性較好。

2.4.3 穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn) 制備供試品溶液1份，分別于配制后0、2、4、6、24h測(cè)定，升麻素苷峰面積RSD＝1.13%，5-O-甲基維斯阿米醇苷峰面積RSD=0.88%，結(jié)果見(jiàn)附表5。顯示供試品溶液在24h內(nèi)基本穩(wěn)定。

2.4.4 加樣回收率實(shí)驗(yàn) 采用加樣回收法，分別精密稱取已知含量的同一批樣品0.08g，平行10份，5份精密加入升麻素苷對(duì)照品溶液（0.0568mg/mL）4mL，另5份精密加入5-O-甲基維斯阿米醇苷對(duì)照品（0.0704mg/mL）2.5mL，測(cè)定并計(jì)算升麻素苷的平均回收率為102.39%，RSD＝2.78%；5-O-甲基維斯阿米醇苷的平均回收率為99.68%，RSD=2.17%，n=5。表明該法加樣回收率合格。結(jié)果見(jiàn)附表6， 7。

2.5 防風(fēng)藥材含量測(cè)定 依照《中國(guó)藥典》2010版一部防風(fēng)項(xiàng)下含量測(cè)定方法測(cè)定所購(gòu)防風(fēng)的升麻素苷和5-O-甲基維斯阿米醇苷總含量，結(jié)果見(jiàn)附表8。顯示本批防風(fēng)藥材中升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷總含量符合藥典規(guī)定。

3 討論

附表7 5-O-甲基維斯阿米醇苷加樣回收率表

附表8 防風(fēng)藥材含量測(cè)定結(jié)果

3.1 用紫外分光光度計(jì)測(cè)定對(duì)照品溶液和樣品溶液，發(fā)254nm處升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷吸收較強(qiáng)，干擾少，故選擇此波長(zhǎng)為檢測(cè)波長(zhǎng)。

3.2 比較了藥典[3]所載甲醇-水系統(tǒng)與本實(shí)驗(yàn)乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相進(jìn)行試驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)乙腈-水系統(tǒng)作為流動(dòng)相升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷的峰形好，保留時(shí)間適中，柱效高。

3.3 本試驗(yàn)用高效液相色譜法對(duì)防風(fēng)中的升麻素苷、5-O-甲基維斯阿米醇苷同時(shí)定量，可以更科學(xué)、準(zhǔn)確地控制藥材質(zhì)量。