RP-HPLC法測(cè)定藥材黑豆中大豆苷的含量

上海海天醫(yī)藥科技開(kāi)發(fā)有限公司（200023）陸泉

黑豆為豆科植物大豆Glycine max ( L. )Merr.的干燥成熟種子，全國(guó)各地均有栽培，主產(chǎn)于山西、河北、陜西[1]，享有“豆中之王”的美譽(yù)。黑豆其性甘味平，色澤較黑，歸脾、腎經(jīng)。主要具有益精明目，養(yǎng)血祛風(fēng)，利水解毒的作用[2]。黑豆含有多種化學(xué)活性成分，主要為黃酮類(lèi)、多糖、色素、皂苷等[3]。2010年版中國(guó)藥典中黑豆以大豆苷為對(duì)照品進(jìn)行藥材鑒別。大豆苷為黃酮類(lèi)成分，具有抗癌、抗氧化、調(diào)節(jié)免疫、防輻射、預(yù)防骨質(zhì)疏松等多種藥理作用[4]。黑豆藥材中大豆苷的含量測(cè)定文獻(xiàn)報(bào)道較少[5]。本文采用RPHPLC法測(cè)定了不同產(chǎn)地黑豆中大豆苷的含量。

1 儀器與材料

1.1 儀器 島津LC-20AD高效液相色譜儀（日本SHIMADZU），SPD-M20A紫外檢測(cè)器（日本SHIMADZU）。BT125D十萬(wàn)分之一分析天平（德國(guó)Sartorius），sk250h型超聲儀（上海科導(dǎo)超聲儀器有限公司），F(xiàn)Z-102型臺(tái)式藥材粉碎機(jī)（上海淀久中藥機(jī)械制造有限公司）。

1.2 材料 大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品（購(gòu)自中國(guó)藥品生物制品檢定所，批號(hào)：111738-200501），甲醇、乙腈（色譜純，美國(guó)TEDIA），娃哈哈飲用純凈水，其余試劑（分析純，市售）。黑豆藥材3批，均為市售品，經(jīng)安徽農(nóng)業(yè)大學(xué)植物學(xué)教研室何金鈴教授鑒定為豆科植物Glycine max (L.)Merr.的干燥成熟種子。

2 方法與結(jié)果

附圖 大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品（A）與樣品（B）的HPLC圖

附表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n = 9）

附表2 黑豆藥材中大豆苷的含量測(cè)定結(jié)果（n = 3）

2.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 色譜柱：cosmosil-C18柱（250mm×4.6mm，5 μm），流動(dòng)相：乙腈-0.1 %三氟乙酸溶液（12∶88， v/v）；柱溫：25℃；流速：1mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：254nm；進(jìn)樣量10 μL。大豆苷在此色譜條件下的保留時(shí)間為9.84 min，分離度＞1.5，按大豆苷計(jì)算理論塔板數(shù)＞4000，色譜峰對(duì)稱(chēng)因子在0.95～1.05之間。色譜圖見(jiàn)附圖。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 取干燥至恒重的大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品約5.55 mg，精密稱(chēng)定，置50 mL容量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，得111.0 μg/mL的大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液。

2.3 供試品溶液制備 黑豆干燥藥材（產(chǎn)地1）粉碎過(guò)篩，取藥材粉末約1.5 g，精密稱(chēng)定，置100 mL平底燒瓶中，加入甲醇50 mL，超聲提取3次，每次30 min。合并提取液，旋蒸至干，殘?jiān)哭D(zhuǎn)移至10 mL容量瓶中，甲醇定容至刻度，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾即得供試品溶液。

2.4 線性關(guān)系的考察 精密吸取大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0、4.0、8.0 mL 置 10 mL容量瓶中，加甲醇定容至刻度，得大豆苷系列標(biāo)準(zhǔn)溶液，在上述色譜條件下，分別進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL，記錄峰面積。以標(biāo)準(zhǔn)品峰面積（Y）為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)品濃度（X，μg/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得大豆苷回歸方程：Y=4959227.96X-16409.98 ( R=0.9999 )。結(jié)果表明，大豆苷在1.11～88.8 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

2.5 精密度試驗(yàn) 取大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液（5.55 μg/mL），在上述色譜條件下，連續(xù)進(jìn)樣6次，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液的RSD為0.35 %。結(jié)果表明，儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn) 取黑豆干燥藥材粉末（產(chǎn)地1），按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作平行制備供試品溶液6份，在上述色譜條件下，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。供試品溶液（產(chǎn)地1）大豆苷的RSD為1.14 %，結(jié)果表明，該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取大豆苷供試品溶液，避光放置，在上述色譜條件下，分別于0、2、4、6、8、10、24 h進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。大豆苷供試品溶液的RSD為0.64%，結(jié)果表明，大豆苷在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn) 取黑豆干燥藥材粉末（產(chǎn)地1）約0.45 g（大豆苷的含量為288.9 μg/g），共9份，精密稱(chēng)定，分別加入相當(dāng)于原藥材大豆苷含量50%、100%、150%的大豆苷標(biāo)準(zhǔn)品溶液，每濃度3份。按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，并在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算含量。根據(jù)加樣回收率公式，計(jì)算加樣回收率，結(jié)果見(jiàn)附表1。大豆苷平均回收率為99.99 %，RSD為1.45 % ( n = 9 )，結(jié)果表明，該方法準(zhǔn)確度良好。

2.9 樣品含量測(cè)定 取各產(chǎn)地黑豆干燥藥材粉末，按“供試品溶液制備”項(xiàng)下操作，并在上述色譜條件下進(jìn)樣分析，進(jìn)樣量10 μL，測(cè)定峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線法計(jì)算大豆苷含量，結(jié)果見(jiàn)附表2。

3 討論

黑豆是黑色食品中的重要一員，有著獨(dú)特的營(yíng)養(yǎng)和藥用價(jià)值，在藥品和食品行列中均占有非常重要的位置。我國(guó)黑豆資源較為豐富，隨著人們對(duì)黑豆?fàn)I養(yǎng)和藥用價(jià)值的逐漸認(rèn)識(shí)和對(duì)黑豆的成分與藥理作用關(guān)系的深入研究，黑豆的開(kāi)發(fā)利用前景將會(huì)更加廣闊。

黑豆為《中國(guó)藥典》2010年版新加入品種，但藥典中尚無(wú)含量測(cè)定項(xiàng)。本文建立了黑豆藥材中大豆苷含量測(cè)定的RPHPLC法，方法簡(jiǎn)單可行，重復(fù)性好，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，為完善黑豆藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供參考。