酶法提取苦豆草生物堿研究

李 軍，郝彩琴，陳海燕，郭鴻雁，冷曉紅（寧夏職業技術學院，寧夏中藥材開發與利用工程技術研究中心，銀川 750021）

苦豆子（Sophora alopecuroides L.）又稱苦甘草、苦豆根，隸屬于豆科槐屬，為多年生草本、根莖地下芽植物，苦豆子藥材主要以全草、種子供藥用，習慣上將苦豆子花期的干燥地上部分作為“苦豆草”［1］；主產于寧夏、內蒙古、山西、陜西、甘肅等地區［2］。苦豆子生物堿的藥理作用主要有鎮靜催眠、鎮痛及降溫、抗心律失常、降血脂、抗病毒、抗炎及免疫抑制作用等［3－4］。臨床應用的有克瀉靈片，治療菌痢、結腸炎和急慢性腸炎；苦參素注射液和苦參素膠囊，可治療慢性乙型病毒性肝炎等［5］。

目前，苦豆草中生物堿的提取方法種類繁多，要進行工業化放大卻存在提取率偏低、設備昂貴、投資大、提取時間長等缺點，而酶法提取不需要更換和新增設備，只是在工藝上加以改進就可提高生物堿的提取率［6－7］。為此，筆者在實驗室酶法提取的基礎上，利用多功能提取濃縮機組對小試相關工藝參數進行優化篩選，并對影響產品質量和生產成本的相關環節進行考察，找到了一種方法可行、提取效果佳的小試提取工藝，為其進一步的中試放大及工業化生產提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 DT－30動態多功能提取濃縮機組（杭州春化自動化研究所）；FQ－120往復式切藥機（山東青州精誠制藥設備有限公司）；TU－1810紫外分光光度計（北京普析通用分析儀器有限公司）；ACS－8電子天平（上海旺豐衡器有限公司）。

1.2 試藥 苦豆草（采于鹽池縣花馬池鎮德勝墩自然村等地），經鑒定為豆科槐屬植物苦豆子（Sophora alopecuroides L.）的花期干燥地上部分，切段備用；纖維素酶（150 000U·g－1）購于寧夏和氏璧生物有限公司；濃鹽酸為國產化學純；其他化學試劑均為分析純。

2 方法

2.1 苦豆草提取物含量測定 苦豆草總生物堿含20多種單體，其中以槐定堿的含量最高，參考相關文獻［8］，采用溴麝香草酚藍比色法以槐定堿為指標成分測定苦豆草總生物堿含量（λ＝410nm）。具體方法如下：

2.1.1 標準曲線的制作 精密稱定槐定堿對照品5.10mg，置于5mL量瓶中，加無水乙醇溶解定容即得槐定堿對照品溶液。取上述溶液0，20，40，60，80，100，120和140μL，分別置于50mL的磨口錐形瓶中，揮盡乙醇，加溴麝香草酚藍pH＝7.6緩沖液12mL、氯仿12mL，密塞劇烈振搖2min，靜置2h后分出氯仿層，以第一個為空白，于410nm處測定對照品溶液的吸光度，以吸光度為橫坐標、氯仿層生物堿質量濃度為縱坐標，進行回歸，得回歸方程：A＝0.012 75C－0.005 71，r＝0.999 8。

2.1.2 樣品含量測定 分別吸取提取液1mL，稀釋至10mL，吸取0.2mL，置于錐形瓶中，加入溴麝香草酚藍pH 7.6緩沖液12mL、氯仿12mL，密塞振搖2min，靜置2h，分取氯仿層，以對應的提取溶劑0.2mL、溴麝香草酚藍pH7.6緩沖液12mL和氯仿12mL同比操作為空白，于410nm處測定提取液的吸光度A，從制作的標準曲線中查得相應的生物堿質量濃度，并計算出苦豆草總生物堿的含量。

2.1.3 精密度實驗 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2項下方法操作，平行測定5次吸光度值，計算RSD。

2.1.4 穩定性實驗 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2項下方法操作，每隔30min于410nm波長處測定吸光度，計算RSD。

2.1.5 重復性實驗 取同一批次提取的苦豆草提取物，按2.1.2項下方法平行制備6份供試品溶液，按上述條件測定吸光度，計算RSD。

2.1.6 回收率實驗 取已知含量的苦豆草提取物0.25mL6份，分別加入1.02mg·mL－1對照品溶液25μL，按2.1.2項下方法制備和測定含量，計算回收率。

2.2 不同提取方法對生物堿提取率的影響 小試規模下，比較傳統提取和酶法提取苦豆草生物堿的提取率，具體步驟如下：前者是先稱取1kg經粉碎的苦豆草段，加入4mL·L－1鹽酸（料液比1∶16），加熱至95℃回流提取4h，濾過，收集濾液，按2.1.2項下方法進行含量測定。后者是稱取1kg經粉碎的苦豆草段，加水適量，同時加入纖維素酶（1∶1 000），加熱至50℃，保溫酶解4h，后加入鹽酸至濃度為4mL·L－1，料液比為1∶16，加熱至95℃回流提取4h，濾過，收集濾液按2.1.2項下方法進行含量測定。

2.3 酶法提取小試工藝條件的優化 在實驗室提取實驗中，已經優化出苦豆草生物堿酶法提取的最適條件為：酶解時間4h，溶劑pH＝6，溫度為50℃，加酶量為1∶1 000，酶解后，加入鹽酸至濃度為4mL·L－1，料液比為1∶20，提取4h。苦豆草生物堿的提取率可達2.24%。在此工作的基礎上，本研究利用小試生產規模的提取罐進行實驗，在酶解參數不變的條件下，考察了提取次數、料液比、提取時間對提取率的影響，篩選出最優的小試工藝條件。

3 結果與分析

3.1 苦豆草提取物含量測定方法學考察

3.1.1 精密度實驗 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2項下方法操作，平行測定5次吸光度值，5次測定結果的RSD為0.208%，說明儀器精密度良好。

3.1.2 穩定性實驗 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2項下方法操作，每隔30min于410nm波長處測定吸光度，RSD為1.42%，結果表明樣品溶液在120min內測定穩定。

3.1.3 重復性實驗 取同一批次提取的苦豆草提取物，按照2.1.2項下方法平行制備6份樣品溶液，按上述條件測定吸光度，6次測定結果的RSD為0.488%，說明方法重復性較好。

3.1.4 回收率實驗 取已知含量的苦豆草提取物0.25mL 6份，后各加入1.02mg·mL－1槐定堿對照品溶液25μL，按2.1.2項下方法制備和測定含量，計算回收率，結果6次測定的回收率平均值為98.51%，RSD為1.99%，說明方法的準確性較好。詳見表1。

表1 回收率測定結果Tab.1 The experiment results of recovery

3.2 小試提取工藝條件的優化

3.2.1 不同提取方法對生物堿提取率的影響 通過比較苦豆草傳統提取和酶法提取2種方法，傳統提取法的提取率為1.46%，而酶法提取的提取率為1.76%，后者較大程度地提高了苦豆子生物堿的提取率，比煎煮提取法提高了26%。

3.2.2 不同提取次數對生物堿提取率的影響 通過對不同提取次數對苦豆草生物堿提取率的實驗，第1次提取的提取率為1.58%，第2次提取的提取率為0.36%，第3次提取的提取率只有0.08%，表明經過2次提取后，苦豆草中的生物堿已基本轉移到溶劑中，考慮綜合成本，以下實驗選擇提取2次。

3.2.3 料液比對生物堿提取率的影響 對1∶10，1∶12和1∶16不同料液比進行生物堿提取率的實驗，結果顯示，隨著料液比的增加，苦豆草生物堿的提取率在不斷增加，當達到1∶16時，提取率最高達到2.08%。故以下實驗選擇料液比1∶16。

3.2.4 不同提取時間對生物堿提取率的影響 在第1次提取生物堿時，生物堿的提取率在提取2h時已經達到1.82%，而后隨著時間的延長基本沒有增加，反而呈下降趨勢，故第1次提取選擇提取2h。而第2次提取1h的生物堿提取率為0.35%，高于提取2h的。故第2次提取選1h。2次提取得出苦豆草生物堿的總提取率為2.17%。

4 討論

從植物中提取有效成分的首要條件是破壞細胞壁，使有效成分快速高效地進入提取溶劑，而大多數植物的有效成分存在于細胞內，因此提取的關鍵是如何有效地打破細胞壁這層壁壘［9］。而纖維素是植物細胞壁的主要成分，亦是胞內大分子溶出的主要屏障，纖維素酶可使纖維素降解為小分子物質，利于胞內成分溶出［10］，因此添加纖維素酶使苦豆草生物堿的提取率有了較大的提高，由原來的1.46%提高到了2.17%。

本研究在實驗室酶法提取的基礎上進行了小試生產條件優化，按照實驗室酶法提取條件放大后進行小試，苦豆草生物堿的提取率僅為1.76%，與實驗室酶法提取中提取率2.24%有一定差距，可能是由于熱量傳導、傳質等實驗條件的改變所致。故對小試生產中的料液比、提取時間、提取次數進行了優化，確定了小規模生產的工藝路線為：酶解時間4h，溶劑pH＝6，溫度為50℃，加酶量為1∶1 000，酶解后，加入鹽酸至濃度為4mL·L－1，料液比1∶16，提取2次，第1次2h，第2次1h。該工藝條件較實驗室提取時，料液比由原來的1∶24改為1∶16，更符合工業生產實際，酶解后酸提的時間由原來的4h縮短為3h，而提取率基本與實驗室提取時接近［11］，提高了生產效率。

本研究開展的纖維素酶法提取小試工藝是藥品從研發到生產的必由之路，也是降低產業化實施風險的有效措施，是聯結中試放大和產業化生產的橋梁，可為產業化生產積累必要的經驗和實驗數據，具有重要意義。但其工藝參數需要在后續的中試工藝中進行驗證，可根據實際情況進行微調，最終確定具體可行的工藝參數［12］，為將其用于苦豆草生物堿的提取和后期的工業化生產奠定基礎。

［1］陳海燕，郭鴻雁，冷曉紅.HPLC法測定西北地區不同產地苦豆子藥材中生物堿的含量［J］.北方藥學，2013，10（5）：10－11.

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［6］鄧志勇.纖維素酶法提取葉下珠總生物堿的工藝研究［J］.食品工業，2013，34（3）：159－161.

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