響應曲面法優化喜樹堿的超聲提取工藝

康大力，沈小鐘，張洪利＊（.廣東食品藥品職業學院，廣州 5050；.廣東省中藥研究所，廣州 5050）

喜樹（Camptotheca acuminata）為珙桐科喜樹屬植物，為我國南方特有品種。1966年，Wall等［1］首次從喜樹中提取并鑒定出具有抗腫瘤活性的生物堿成分喜樹堿（camptothecin），并于20世紀70年代開始了喜樹堿的臨床研究。迄今為止，喜樹堿類抗癌藥物仍是唯一一類上市的拓撲異構酶Ⅰ阻斷劑。irinotecan和topotecan這2種喜樹堿衍生物已被批準上市用于多種癌癥的治療［2］。目前，喜樹堿衍生物的獲得主要從喜樹原植物中直接分離提取或由喜樹堿進行結構修飾得到。

由于天然材料中化學成分復雜，次生代謝產物的含量較低，因此，必須優選簡便、高收率的提取方法，并建立快速、準確、靈敏的檢測方法，以滿足次生代謝產物研究的需要。近年來，超聲提取逐漸成為新興起的一種提取方法，超聲波具有空化、攪拌、粉碎等作用，可以破壞細胞壁，使溶劑進入到細胞中充分溶解有效成分，與傳統提取方法比，具有時間短、操作簡便、不需要加熱等特點［3］。本文采用響應曲面設計實驗優化喜樹堿的提取方法，通過對響應面的分析優選最佳工藝，利用其直觀、高效、簡便等特點［4－6］，考察溫度、時間、料液比等因素對喜樹堿提取率的影響，為喜樹堿及其衍生物生產提供研究基礎。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜系統（Waters公司，美國），配備DAD檢測器，色譜柱為C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm，Phenomenex 110A）。

1.2 試藥 藥材采集于廣東省中藥研究所中藥標本園，經成都中醫藥大學峨嵋學院劉曉春副教授鑒定為珙桐科喜樹屬植物喜樹（Camptotheca acuminata Decne.）的果實；用自來水洗凈，室溫下陰干，粉碎，于45℃烘干至恒質量；乙腈（色譜純，天津市協和昊鵬色譜科技有限公司，批號：090810）；喜樹堿對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號100532－200401）。

2 方法與結果

2.1 響應曲面法設計喜樹堿的提取工藝 利用Design－Expert軟件設計響應曲面實驗，采用體積分數60%的乙醇為提取溶劑，以提取溫度、提取時間、料液比3個因素為自變量，以喜樹果實粉末為材料，超聲提取為基本方法，喜樹堿的得率為響應值，設計響應面分析實驗，包括析因實驗和中心實驗共17次，因素水平分析選取［7］，見表1。

表1 因素水平表Tab.1 Factors and levels

2.2 喜樹堿含量測定 色譜條件：使用梯度流動相（0～15min，25%乙腈線性升高到50%乙腈，梯度洗脫；15～18min，等度洗脫；18～19min，50%乙腈線性降至25%乙腈；19～20min，等度洗脫），流速1.0mL·min－1，柱溫為30℃，進樣量10μL。

對照品溶液的制備：取喜樹堿對照品，精密稱定，采用甲醇溶解制成質量濃度為1mg·mL－1的儲備液，用時分別取0.5，1.0，2.0，4.0和8.0mL的儲備液，用甲醇定容10mL，搖勻，配成一系列不同質量濃度的對照品溶液。

供試品溶液的制備：稱取2.0g喜樹果實粉末，裝入250mL錐形瓶中，按照表1的因素水平表進行實驗，提取液經濾紙過濾，水浴揮干溶劑，用甲醇溶解、定容至10mL，0.22μm 微孔濾膜過濾，進HPLC分析儀定量分析。

2.3 響應曲面分析結果 按照表1進行響應曲面分析實驗，用體積分數60%乙醇超聲提取喜樹果實喜樹堿，響應曲面實驗方案與結果見表2。統計分析結果見表3。

對表2中的數據采用Design Expert軟件擬和得到提取溫度（A）、提取時間（B）、料液比（C）與喜樹堿得率之間的二次多項回歸方程：

喜樹堿得率（%）＝00.45＋1.850×10－3A ＋2.862×10－3B－7.125×10－4C－6.500×10－4AB－9.500×10－4AC－4.750×10－4BC－2.288×10－3A2－2.813×10－3B2－1.162×10－3C2

根據回歸方程做出的各因素的喜樹堿得率響應面和等高線圖。考察響應面、等高線的形狀，分析提取溫度、提取時間和料液比對喜樹堿提取率的影響，結果見圖1～3，各因素及其相互作用對提取率的影響可以通過響應面圖和等高線圖直觀反映出來，最佳工藝為：提取溫度49℃，提取時間2.5h，料液比1∶17。

從圖中可看出3種因素對喜樹堿提取率的影響，提取時間對提取率影響最顯著、溫度次之，表現為曲面較陡，料液比對喜樹堿提取率的影響較小，表現為曲面較緩。

表2 響應曲面實驗結果Tab.2 Results of response surface analysis

表3 統計分析結果Tab.3 Results of mathematic regression analysis

圖1 喜樹堿提取溫度、提取時間響應曲面及等高線圖A.響應曲面圖；B.等高線圖Fig.1 Response surface graph and contour line graph of extraction temperature and extraction time of CPTA.response surface graph；B.contour line graph

圖2 喜樹堿提取溫度、料液比響應曲面及等高線圖A.響應曲面圖；B.等高線圖Fig.2 Response surface graph and contour line graph of extraction temperature and solid－liquid ratio of CPTA.response surface graph；B.contour line graph

圖3 喜樹堿提取時間、料液比響應曲面及等高線圖A.響應曲面圖；B.等高線圖Fig.3 Response surface graph and contour line graph of extraction time and solid－liquid ratio of CPTA.response surface graph；B.contour line graph

較長的提取時間和較高的提取溫度有利于喜樹堿的提取，但考慮到成本與成分的穩定性，不能無限延長提取時間和增加溫度。另外，可能由于喜樹堿的含量較低，喜樹堿含量不易達到飽和，提取料液比對喜樹堿提取率影響不顯著。

2.4 驗證實驗 通過Design Expert軟件計算并分析得到最優條件：提取溫度49℃，提取時間2.5h，料液比1∶17，在此條件下提取喜樹果實喜樹堿，實驗重復3次，平均提取率為0.048 5%，與預測值0.05%接近。

3 討論

為考察各提取因素對喜樹堿提取率的影響，達到喜樹堿提取率最大化，本文選擇了喜樹堿含量最高的部位果實進行了喜樹堿提取工藝優選，以響應曲面法來進行參數的設計與擬合。響應曲面法的原理是將選定影響因子與檢驗目的指標擬合，得到多元二次回歸函數，能夠通過響應曲面圖和等高線圖研究影響因子與響應值、因子與因子之間的相互關系，從而以較少的操作次數在短時間內對所研究的工藝進行優選。本實驗得到以喜樹堿為響應面值的響應面圖和等高圖，通過對實驗結果的分析，確定了最佳工藝，為實際生產及喜樹資源的充分利用提供參考。

［1］Wall M E，Wani M C，Cook C E，et al.Plant antitumor agents I.The isolation and structure of camptothecin，a novel alkaloidal leukemia and tumor inhibitor fromCamptotheca acuminata［J］.J Am Chem Soc，1966，88：3888－3890.

［2］Takimoto C H，Wright J，Arbuck S G..Clinical applications of the camptothecins［J］.Biochim Biophys Acta，1998，1400：107－119.

［3］王甫成.超聲技術在中藥化學成分提取中的研究進展［J］.廣州化工，2010，38（8）：11－12.

［4］沈小鐘，楊帆，于榮敏.響應曲面法優選黃芪提取工藝［J］.中國實驗方劑學雜志，2012，18（18）：34－37.

［5］白璐，賀文娟，崔春利，等.Box－Behnken響應面法優化延胡索配方顆粒的提取工藝［J］.西北藥學雜志，2013，28（1）：1－4.

［6］謝瑩瑩，王志祥，史益強，等.響應曲面法優化超臨界CO2萃取丁香酚的工藝研究［J］.西北藥學雜志，2013，28（2）：122－125.

［7］徐秀泉，于榮敏，劉柯，等.響應曲面法優化茅蒼術多糖的提取工藝［J］.安徽農業科學，2011，39（20）：12082－12085.