HPLC法測定和血明目片中黃芩苷的含量

田 園，王海亮，解笑瑜，王嗣岑＊（.西安交通大學藥學院，西安 7006；.西安碑林藥業股份有限公司，西安70048）

和血明目片是由蒲黃、丹參、地黃、墨旱蓮、菊花、黃芩（炭）、決明子等19味中藥組成的復方制劑，具有涼血止血、滋陰化瘀、養肝明目等功效，用于陰虛肝旺，熱傷絡脈所引起的眼底出血［1］。黃芩為和血明目片的藥材之一，具有清熱燥濕、瀉火解毒等功效，其中黃芩苷為黃芩的主要成分。目前，國家食品藥品監督管理局批準的和血明目片標準中僅有丹參素的含量測定，無黃芩苷的含量測定方法，故參考有關文獻［2－5］，建立反相高效液相色譜法測定和血明目片中黃芩苷的含量。經方法學考察，該法具有簡便、準確、重復性好等優點，可用于和血明目片的質量控制。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Dionex UltiMate3000SD全自動高效液相色譜儀，UltiMate 3000二極管陣列檢測器（美國戴安公司）；DenverTP214分析天平（奧豪斯儀器上海有限公司）；Precisa ES225SM－DR（十萬分之一）天平（普利賽斯國際貿易（上海）有限公司）。

1.2 試藥 黃芩苷對照品（批號110715－200815）購于中國食品藥品檢定研究院；和血明目片由西安碑林藥業股份有限公司提供（批號201310034，201310035，201310036）；乙醇為分析純（利安隆（天津）化工公司）；甲醇為色譜純；水為超純水；其余試劑為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性實驗 色譜柱：ODS Hypersil C18色譜柱（250mm ×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇－水－磷酸（47∶53∶0.2）［6］；檢測波長：280nm；流速：1.0mL·min－1；柱溫30 ℃；進樣量10μL。在此條件下，黃芩苷與和血明目片中其他組分色譜峰基線分離且陰性樣品無干擾。表明該方法有較強的專屬性；理論板數不低于2 500。色譜圖見圖1。

2.2 對照品溶液的制備及最大吸收波長的選擇 配制一定質量濃度的對照品溶液，精密進樣10μL，在波長范圍190～460nm內掃描吸收光譜，結果在278.3nm處有最大吸收。參考《中國藥典》2010年版一部黃芩中黃芩苷的含量測定波長，選用280nm為檢測波長。

2.3 供試品溶液制備 精密稱取和血明目片適量，除去包衣，研細，取約0.5g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入體積分數50%甲醇25mL密塞，稱定質量，搖勻，超聲處理10min（功率250W，頻率40kHz），放冷，再稱定質量，用體積分數50% 甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

圖1 HPLC圖A.黃芩苷對照品；B.陰性對照；C.和血明目片；1.黃芩苷Fig.1 HPLC chromatogramsA.baicalin reference；B.negative control；C.Hexuemingmu Tablets；1.baicalin

2.4 陰性樣品溶液的制備 取按處方比例及生產制備方法，制備不含黃芩的陰性樣品，按照2.3項下的制備方法制成陰性樣品溶液。

2.5 線性關系考察 取2.2項對照品儲備液適量，用甲醇－水（1∶1）制備質量濃度分別為0.026 2，0.065 6，0.131 2，0.262 4和0.393 6mg·mL－1的系列對照品溶液，按上述色譜條件測定峰面積。以進樣質量濃度（X）為自變量、峰面積（Y）為因變量，得回歸方程：Y＝26 234 X＋17.382，r＝0.999 9（n＝5）。結果表明，在此色譜條件下，黃芩苷在0.026 2～0.393 6mg·mL－1范圍內線性關系良好。

2.6 精密度實驗 精密吸取黃芩苷對照品溶液，在2.1色譜條件下連續進樣5次，記錄峰面積。結果黃芩苷峰面積的RSD為1.21%（n＝5），結果表明儀器精密度良好。

2.7 穩定性實驗 精密吸取同一批供試品（批號201310034），分別于0，2，4，6，8，12和24h，按照2.1色譜條件測定黃芩苷不同時間的峰面積，RSD為1.23%，說明供試品溶液在24h內穩定性良好。

2.8 重復性實驗 取同一批號（201310034）樣品6份，按2.3項下方法制備供試品溶液，在2.1項色譜條件下進行分析。共測定6次，結果黃芩苷含量的平均值為2.965mg·片－1（n＝6），RSD為0.7%，表明重復性較好。

2.9 加樣回收率實驗 精密稱取已知含量（黃芩苷含量為9.884mg·g－1）的和血明目片6份，每份約0.25g，分別精密加入黃芩苷對照品0.495 2mg·mL－1的溶液5mL，再精密加入體積分數50%甲醇20mL。按上述確定的方法制成供試品溶液，測定樣品中的含量，計算回收率，結果黃芩苷的平均回收率為96.3%，RSD為1.6% ，結果表明本法回收率良好。見表1。

表1 黃芩苷回收率實驗結果Tab.1 Results of recovery of baicalin（n＝6）

2.10 樣品的測定 分別取3個批號的和血明目片，每批樣品取2份，在2.3項下方法制備供試品溶液。精密進樣10μL，在上述色譜條件下進樣分析，測定峰面積，用外標法計算黃芩苷的含量，測定結果3批樣品的平均含量分別為2.980 5，2.940 0和2.975 2mg·片－1。

3 討論

在供試品溶液的制備方法中，首先對提取溶媒進行考察，分別用甲醇、乙醇、體積分數50%甲醇、體積分數50%乙醇提取，結果表明，體積分數50%甲醇提取黃芩苷含量最高；對提取方式進行考察，分別用超聲提取和回流提取，結果表明，超聲提取含量高且操作簡便；對超聲提取進行考察，分別超聲5，10，20和30min，結果表明超聲10min即可提取完全。

在對流動相考察中，分別用甲醇－水體系和乙腈－水體系進行實驗，結果表明，流動相為甲醇－水－磷酸（47∶53∶0.2）時即可達到基線分離，且黃芩藥材陰性樣品無干擾［7］。

和血明目片生產工藝中，黃芩等藥材打粉入藥，丹參等藥材加水煎煮，藥粉同浸膏混合制粒壓片。目前執行的藥品標準，僅對丹參素的含量進行測定，即對提取工藝進行控制，未對打粉工藝進行含量控制，故建立黃芩苷的含量測定方法，可對打粉工藝進行質量控制。目前僅對3批和血明目片進行了含量測定，數據較少，還需進一步測定多批樣品，積累有關數據，擬定合理限度。

［1］王輝，高健生.和血明目片方義及臨床應用［J］.湖南中醫藥大學學報，2010，30（12）：17－18.

［2］呂士杰，李妍，蘆曉晶，等.HPLC測定芩丹顆粒中黃芩苷、梔子苷和丹皮酚［J］.中國實驗方劑學雜志，2010，16（6）：81－84.

［3］陸祥，宋劍鋒.RP－HPLC法測定止血祛瘀明目片中黃芩苷含量［J］.浙江中醫雜志，2011，46（12）：921－922.

［4］陳珂，宋嵐，祁明，等.高效液相色譜法測定杏杷止咳顆粒中黃芩苷含量［J］.中國藥業，2011，20（1）：26－27.

［5］李玲玲，趙蘭芬.清開靈不同制劑中黃芩苷的含量測定［J］.藥物分析雜志，2011，31（5）：950－953.

［6］國家藥典委員會.中國藥典2010年版［S］.一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：2831.

［7］薛磊冰，周燕，金佩芬.HPLC法測定婦炎康復片中黃芩苷和橙皮苷的含量［J］.西北藥學雜志，2010，25（6）：405－406.