氣相色譜法測定硝酸咪康唑原料的殘留溶劑

張秉華，馬雯霞，王 發（.陜西省食品藥品檢驗所，西安 7006；.西安醫學院第二附屬醫院，西安 70038）

硝酸咪康唑為咪唑類廣譜抗真菌藥，其對五官、陰道、皮膚等部位的真菌感染均有效，臨床上主要用于治療深部真菌病。硝酸咪康唑通過抑制真菌細胞膜的固醇合成、影響細胞膜的通透性，從而抑制真菌生長，導致真菌死亡。其在4μg·mL－1的質量濃度下對新型隱球菌、假絲酵母菌和粗孢子菌均呈敏感反應，可抑制大部分臨床分離的真菌，并且對金葡菌和鏈球菌及革蘭陽性球菌和炭疽菌等也有一定抗菌作用［1］。結合硝酸咪康唑原料合成、純化工藝中用到的有機溶劑，并參考《中國藥典》2010年版二部附錄殘留溶劑測定法的指導原則［2］及有關文獻［3－9］，決定對硝酸咪康唑原料中可能殘留的丙酮和甲苯建立相應的氣相色譜法進行測定，并使用建立的方法測定了國內原料生產企業的3批硝酸咪康唑原料的殘留有機溶劑水平。由實驗結果來看，以N，N－二甲基甲酰胺為溶劑的殘留溶劑氣相色譜測定方法，簡便快速，結果準確，重復性好。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 6890N氣相色譜儀，FID檢測器；全自動空氣源SPB－3型（北京中惠普分析技術研究所）。

1.2 試藥 硝酸咪康唑原料由廣東順峰藥業有限公司提供，批號為20071101，20071102，20071103。丙酮（國藥集團化學試劑有限公司提供，批號為T20110214）和甲苯（國藥集團化學試劑有限公司提供，批號為20100203），均為分析純。N，N－二甲基甲酰胺為色譜純（國藥集團化學試劑有限公司提供，批號為11060005）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件的選擇與優化

2.1.1 確定樣品中所涉及的殘留溶劑種類 通過企業提供的硝酸咪康唑原料生產工藝中涉及的有機溶劑，并結合《中國藥典》2010年版中規定應控制的溶劑，初步確定控制硝酸咪康唑原料中的二類溶劑甲苯和三類溶劑丙酮。并且選擇等溫條件，通過新建立的氣相色譜方法，將樣品質量濃度由0.1g·mL－1提高至0.2g·mL－1后進樣，結果未發現其他殘留有機溶劑色譜峰。通過上述預實驗，最終確定硝酸咪康唑中控制的殘留溶劑為甲苯和丙酮。

2.1.2 氣相色譜檢測方法的建立

2.1.2.1 色譜柱的選擇 通過比較不同填料及材質的填充柱（玻璃柱和不銹鋼柱）和不同極性的石英毛細管色譜柱，待測組分在高分子多孔小球不銹鋼（或玻璃）填充柱中各組分分離效果也較好，但峰形較寬，柱效偏低。若選擇非極性和中等極性的毛細管柱則分離情況不如DB WAX（PEG－20M）的極性石英毛細管柱。故最終選擇 DB WAX（PEG－20M）石英毛細管柱。

2.1.2.2 溶劑的選擇 由硝酸咪康唑的溶解性可知，其在水中幾乎不溶，易溶于N，N－二甲基甲酰胺。實驗發現，選用N，N－二甲基甲酰胺做溶劑，樣品與對照品均溶解完全，且硝酸咪康唑在N，N－二甲基甲酰胺中溶解度較大，當質量濃度達到0.1g·mL－1時仍為真溶液狀態（可以很好地提高方法的檢測限）。并且N，N－二甲基甲酰胺溶劑本身對本實驗無干擾。

2.1.2.3 優化色譜條件 在60℃等溫條件下各待測組分及溶劑均能夠很好分離，但N，N－二甲基甲酰胺峰保留時間過長，同時考慮樣品中可能的殘留，選擇待測組分分離后對色譜柱進行程序升溫。經過實驗最終選擇的色譜條件為：進樣口溫度為200℃；檢測器為FID，檢測器溫度為250℃；載氣為氮氣；色譜柱為PEG－20M 毛細柱（30m×0.25mm，0.25μm），柱溫為程序升溫，初始溫度60℃，保持3min，再以30℃·min－1的升溫速率升至185℃，保持20min。經優化過的色譜條件，各組分分離良好。色譜圖見圖1。

圖1 氣相色譜圖a.空白溶液；b.樣品；c.對照品；1.丙酮；2.甲苯；3.N，N－二甲基甲酰胺Fig.1 GC chromatogramsa.blank solution；b.sample；c.reference substances；1.acetone；2.toluene；3.N，N－dimethylformamide

2.2 線性關系考察 混合對照品溶液的配制 精密稱取丙酮、甲苯2種有機溶劑各適量，用N，N－二甲基甲酰胺制成含丙酮5mg·mL－1、甲苯0.89mg·mL－1的混合對照品儲備液。精密量取上述對照品儲備液5mL，置于50mL量瓶中，用N，N－二甲基甲酰胺稀釋至刻度，搖勻，作為混合對照品溶液。

精密量取對照品儲備溶液適量，加N，N－二甲基甲酰胺稀釋制成含丙酮0.25～1.0mg·mL－1和甲苯0.044 5～0.178mg·mL－1的系列質量濃度對照品溶液。按上述氣象色譜方法進樣測定，以對照品溶液峰面積為縱坐標（Y）、質量濃度為橫坐標（X），建立線性回歸方程。結果見表1。

表1 回歸方程與線性范圍Tab.1 Linear range and regression equations of calibration curves

2.3 檢測限與定量限 取對照品儲備液，精密量取不同體積并逐步稀釋，按上述色譜方法進樣并測定，當所測殘留溶劑的信噪比達到要求時，丙酮、甲苯檢測限（S／N＝3）分別為0.002 5和0.000 445mg·mL－1；定量限（S／N＝10）分別為0.005和0.000 89mg·mL－1。

2.4 精密度實驗 取混合對照品溶液依照建立的氣相色譜方法測定，重復5次進樣，通過5次測定的峰面積進行計算。結果所測5次丙酮、甲苯峰面積的RSD分別為0.9%和1.2%。實驗結果表明，本方法精密度良好。

2.5 重復性實驗 取已知溶劑含量的硝酸咪康唑原料作為供試品，精密稱定供試品5g，置于50mL量瓶中，精密加入混合對照品儲備液5.0mL，用N，N－二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，制備成重復性實驗樣品溶液，通過3d連續按照上述氣相色譜方法重復測定樣品中各有機溶劑的量，3d的測定結果分別為：丙酮加樣回收率為99.9%，101.5%和100.5%；甲苯加樣回收率為101.2%，98.6%和99.7%。日間重復性的2組分回收數據表明，本色譜方法重復性良好。

2.6 回收率實驗 取已知溶劑含量的硝酸咪康唑原料作為供試品，分別精密稱定9份供試品5g，分別置于50mL量瓶中，分別精密加入混合對照品儲備液4.0，5.0和6.0mL，每個質量濃度各加3份（共9份），用N，N－二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，制得相當于檢查限度3個水平（80%，100%，和120%）的溶液。依照上述的氣相色譜方法測定并計算回收率。3個水平的回收率測定結果分別為：低水平丙酮和甲苯回收率分別為100.9%和98.9%，中水平丙酮和甲苯回收率分別為100.2%和101.1%，高水平丙酮和甲苯回收率分別為99.8%和99.6%。實驗結果表明，本色譜方法回收率良好。

2.7 硝酸咪康唑樣品的測定 分別取硝酸咪康唑原料約1g，精密稱定，置于10mL量瓶中，加N，N－二甲基甲酰胺溶解并稀釋至刻度，作為供試品溶液，按照上述氣相色譜方法進行測定，2種殘留溶劑丙酮和甲苯均有檢出，但其殘留溶劑量均小于《中國藥典》2010年版二部中所規定的限度（丙酮的限度0.5%、甲苯的限度0.089%）。廣東順峰藥業有限公司的3批硝酸米康唑原料殘留溶劑測定結果分別為：丙酮殘留分別為0.006 2%，0.007 5%和0.006 5%；甲苯殘留分別為0.008 9%，0.009 3%和0.009 0%。

3 討論

本方法快速，準確，樣品制備簡便，對硝酸咪康唑原料中的丙酮和甲苯殘留溶劑能夠有效控制。但考慮到不同生產企業的生產工藝有可能存在不同，在原料的合成與純化過程中使用的有機溶劑種類也可能并不一致。所以本方法在針對特定殘留溶劑的測定時，具有很大的不確定性。最好的解決方法應當是結合各生產企業具體的生產工藝，并廣泛收集樣品，在考察不同的原料生產企業的不同樣品的具體情況下，建立相應的多種溶劑檢出方法，這樣可以有效地避免殘留溶劑的漏檢情況。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典臨床用藥須知：化學藥與生物制品卷［S］.北京：中國醫藥科技出版社，2010：1337－1338.

［2］國家藥典委員會.中國藥典2010年版［S］.二部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄61－65.

［3］ICH指導委員會.藥品注冊的國際技術要求（質量部分）［S］.北京：人民衛生出版社，2002：79－100.

［4］石濤，陳振德.頂空氣相色譜法測定制劑包衣中乙醇和二氯甲烷殘留量［J］.西北藥學雜志，2009，24（4）：251－252.

［5］秦立，胡昌勤.氣相色譜保留時間預測在藥品殘留溶劑中的應用［J］.藥物分析雜志，2000，26（10）：1469－1471.

［6］李婕，黃海，偉張紅.毛細管氣相色譜法測定來氟米特有機溶劑殘留量［J］.西北藥學雜志，2010，25（1）：3－4.

［7］張靜，徐三能.頂空氣相色譜法測定比阿培南的有機溶劑殘留量［J］.安徽醫藥，2011，32（1）：36－38.

［8］李祥勝，楊瑾.氣相色譜法測定恩替卡韋原料藥中有機溶劑殘留量［J］.安徽醫藥，2012，33（11）：1594－1596.

［9］王發，徐春燕，王嫦鶴，等.頂空氣相色譜法測定聚桂醇中環氧乙烷和二氧六環的含量［J］.安徽醫藥，2013，34（1）：33－34.