HPLC法同時測定腰腿痛丸中麻黃堿、士的寧及馬錢子堿的含量

吳春燕，賈建忠，李小安，肖 娟，張轉平，崔 磊（.安康市食品藥品檢驗所，安康 75000；.銅川市食品藥品檢驗檢測中心，銅川 7703）

腰腿痛丸是由人參、馬錢子（制）、麻黃、牛膝等17味中藥制成的中藥制劑，具有強筋健骨、舒筋活血的功效。收載于衛生部藥品標準中藥成方制劑（第十六冊），質量標準中無含量測定項［1］。麻黃和馬錢子為方中主藥，其主要有效成分為麻黃堿、士的寧和馬錢子堿。為有效控制該產品的質量，在對藥材進行真偽鑒別的基礎上，采用高效液相色譜法（HPLC）同時測定腰腿痛丸中麻黃堿、士的寧和馬錢子堿的含量。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200液相色譜儀，配紫外可見光可變波長檢測器；Agilent C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；KH5200超聲波清洗器（昆山禾創超聲儀器有限公司）；超純水機（上海摩勒生物科技有限公司）；AB135－S電子分析天平（德國梅特勒）。

1.2 試藥 鹽酸麻黃堿對照品（批號0714－9903，含量測定用）；士的寧對照品（110705－200005，含量測定用）；馬錢子堿對照品（批號 0706－9403，含量測定用）；水為超純水；乙腈為色譜純；磷酸為分析純。腰腿痛丸樣品（山東百草藥業有限公司，批號08080501，08080601，08080609）。

2 方法與結果

2.1 色譜條件 色譜柱：Agilent C18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈－1mL·L－1磷酸（12∶88）；流速：1.0mL·min－1；檢測波長：210和254nm；進樣量：10μL；柱溫：30℃。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品儲備液 取鹽酸麻黃堿對照品約5mg，精密稱定，置于10mL量瓶中，加三氯甲烷－甲醇（1∶1）溶解并定容至刻度，搖勻；另分別取士的寧、馬錢子堿約10mg，精密稱定，置于同一10mL量瓶中，加三氯甲烷溶解并定容至刻度，搖勻。取上述對照品溶液各1mL，置于同一10mL量瓶中，加三氯甲烷至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密量取對照品儲備液1.0mL，置于10mL量瓶中，加三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.3 供試品溶液 取本品研細，取約10g，精密稱定，置于250mL三角錐形瓶中，加50mL·L－1鹽酸溶液50mL，加熱回流2h，放冷，濾過，用200g·L－1氫氧化鈉溶液調節pH值至10～11，用三氯甲烷振搖提取3次，每次20mL，合并三氯甲烷液，蒸干，加三氯甲烷少許溶解轉移至10mL量瓶中，用三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續濾液，作為供試品溶液。

2.2.4 空白溶液 取不含麻黃及馬錢子的樣品10g，精密稱定，按2.2.3項下方法制備空白溶液。

2.3 專屬性實驗 分別精密量取2.2項下的對照品溶液、供試品溶液、空白溶液各10μL進樣，記錄色譜圖。結果供試品溶液在與對照品溶液相同保留時間處有一致的色譜峰，空白溶液不干擾麻黃堿、士的寧及馬錢子堿的檢出，見圖1。

圖1 HPLC圖A.對照品；B.樣品；C.空白溶液；1.麻黃堿2.士的寧3.馬錢子堿Fig.1 HPLC chromatogramsA.reference substances；B.sample；C.blank；1.ephedrine；2.strychnine；3.brucine

2.4 線性關系考察 精密吸取對照品儲備液1，1，1，2和5mL，分別置于50，25，10，10和10mL量瓶中，加三氯甲烷稀釋至刻度，搖勻。依次進樣，記錄色譜圖，以峰面積（Y）與質量濃度（X）繪制標準曲線并進行線性回歸計算，麻黃堿、士的寧及馬錢子堿標準曲線回歸方程分別為：麻黃堿Y＝20.921X－1.068 5，r＝0.999 9；士的寧Y＝23.717X－4.183 7，r＝0.999 8；馬錢子堿Y＝14.677X＋0.301 3，r＝0.999 9。結果表明麻黃堿、士的寧及馬錢子堿分別在1～25，2～50和2～50μg·mL－1范圍內線性關系良好。

2.5 耐用性實驗 分別更換色譜柱品牌及液相色譜儀，按照上述色譜條件進樣，結果3種成分峰形對稱性良好，分離度均大于1.5。

2.6 精密度實驗 精密吸取對照品溶液10μL注入液相色譜儀，連續進樣5次，測得麻黃堿峰面積RSD為0.47%，士的寧峰面積RSD為0.49%，馬錢子堿峰面積RSD為0.58%，精密度良好。

2.7 重復性實驗 取同一批號的腰腿痛丸，按2.2.3項下方法平行制備6份溶液進行測定，結果麻黃堿RSD為1.1%，士的寧RSD為1.0%，馬錢子堿RSD為1.3%，表明該方法的重復性良好。

2.8 穩定性實驗 精密吸取樣品溶液10μL，分別在0，2，4，8和12h內進樣，記錄峰面積，結果3種成分的RSD均小于2.0%。

2.9 加樣回收率實驗 稱取已知含量的樣品9份，精密稱定，3份為1組，每組分別加入低、中、高3種質量濃度的對照品溶液，按2.2.3項下方法制備溶液，進行測定，計算回收率，麻黃堿平均回收率為98.7%，RSD為1.8%；士的寧平均回收率為99.1%，RSD為1.1%；馬錢子堿平均回收率為97.9%，RSD為2.3%。見表1、表2和表3。

表1 麻黃堿加樣回收率實驗結果Tab.1 Results of ephedrine addition recoveries

表2 士的寧加樣回收率實驗結果Tab.2 Results of strychnine addition recoveries

2.10 檢測限和定量限 取對照品溶液加三氯甲烷分別稀釋制成不同質量濃度的溶液測定。當信噪比約為3∶1時，注入儀器的樣品量即為檢測限，當信噪比約為10∶1時，注入儀器的樣品量即為定量限。麻黃堿檢測限為0.5μg·mL－1，定量限為1.67μg·mL－1；士的寧檢測限為3μg·mL－1，定量限為10μg·mL－1；馬錢子堿檢測限為7.5μg·mL－1，定量限為25μg·mL－1。

表3 馬錢子堿加樣回收率實驗結果Tab.3 Results of brucine addition recoveries

2.11 樣品測定 按2.2.3項下方法對3批樣品進行含量測定。結果3批樣品中麻黃堿含量分別為92.8，93.5和92.9μg·g－1；士的寧含量分別為107.5，105.8和106.9μg·g－1；馬錢子堿含量分別為76.4，77.2和76.8μg·g－1。

3 討論

腰腿痛丸中含有國家嚴格控制品種麻黃和馬錢子，其中的麻黃堿、士的寧和馬錢子堿為其主要成分，本實驗旨在建立一種簡易、可行的方法同時測定其含量來控制藥品的質量。實驗中分別考察不同流動相體系，包括藥典［2］中分別測定麻黃堿、士的寧和馬錢子堿流動相，結合文獻資料最終選用乙腈－1mL·L－1磷酸（12∶88）作為流動相系統［3－7］。

麻黃堿在210nm處有最大吸收，士的寧、馬錢子堿在254nm有最大吸收。本實驗在0～9min內檢測波長選為210nm，9～30min選為254nm，通過波長的切換實現3種生物堿的同時檢測。

本實驗建立了HPLC法同時測定腰腿痛丸中3種生物堿的含量，方法簡便易行，結果準確，重復性好，可作為腰腿痛丸的質量控制方法。

［1］衛生部藥典委員會.中藥成方制劑：第16冊［S］.1998：192－193.

［2］國家藥典委員會.中國藥典2010年版［S］.一部.北京：中國醫藥科技出版社，2010：47－300.

［3］呂霞，郭青，鐘文英.GC－M S法測定疏風活絡丸中偽麻黃堿、麻黃堿、士的寧和馬錢子堿的含量［J］.中國藥科大學學報，2008，39（6）：519－522.

［4］王亞靜.HPLC同時測定腰痛寧貼片中的士的寧和馬錢子堿［J］.華西藥學雜志，2011，26（1）：73－74.

［5］那微，張清波，張淑華，等.HPLC法測定骨筋丸系列品種中馬錢子堿和士的寧［J］.中成藥，2012，34（4）：759－761.

［6］董自波，李超.HPLC法測定三拗片中鹽酸麻黃堿和鹽酸偽麻黃堿的含量［J］.西北藥學雜志，2011，26（5）：329－330.

［7］司曉萍，李琦.RP－HPLC法測定骨筋丸膠囊中士的寧的含量［J］.藥物分析雜志，2010，30（10）：1960－1962.