婦科千金片對慢性盆腔炎模型大鼠卵巢組織caspase－3和caspase－8表達的影響

聶 晶，李 鑫，2，師振予，3＊，郭建生，3（.湖南中醫藥大學中藥現代化研究重點實驗室，長沙 40208；2.湖南中醫藥大學中醫診斷研究所，長沙 40007；3.國家中藥學藥管局中藥藥性與藥效實驗室三級科研實驗室，長沙 40208）

婦科千金片由千斤拔、金櫻根 、當歸、黨參、雞血藤、穿心蓮、單面針、功勞木等八味中藥組成，具有清熱解毒、活血化瘀、補氣養血之功效。該藥在臨床已廣泛使用，對于濕熱下注、兼氣血不足引起的急慢性盆腔炎、子宮內膜炎等婦科常見病具有顯著療效［1－2］。我們前期研究發現，婦科千金片對急性盆腔炎大鼠的免疫球蛋白具有調節作用，可提高機體免疫能力［3］，對大鼠子宮、卵巢、輸卵管等盆腔組織起到保護作用［4］，還可以通過降低大鼠子宮、卵巢組織 NF－κB蛋白、IL－6mRNA，調控基因轉錄環節發揮抗炎免疫作用［5－6］。本研究擬觀察婦科千金片對大鼠慢性盆腔炎模型卵巢組織caspase－3和caspase－8蛋白表達的影響，從細胞凋亡角度探討和完善其治療慢性盆腔炎的作用機制。

1 儀器與材料

1.1 儀器 Shandon325型石蠟切片機（英國Shandon公司）；JY3002型電子天平（上海精密科學儀器有限公司）；Motic B5顯微攝像系統（麥克奧迪實業集團公司）。

1.2 試藥 婦科千金片（株洲千金藥業股份有限公司，批號20110901）；婦炎康片（湖南湘泉制藥有限公司，批 號 111105）；caspase－3 免 疫 組 化 試 劑 盒、caspase－8免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限 公 司）；大 腸 桿 菌 （Escherichia coli，菌 種 號26002），金黃色葡萄球菌（Staphyloccocus aureus，菌種號44152），解脲脲原體（M.urealyticum，菌種號52011），由湖南中醫藥大學免疫與微生物教研室伍參榮教授惠贈。

1.3 動物 SD大鼠（長沙斯萊克景達實驗動物有限公司，許可證號 SCXK（湘）2009－0004），雌性，SPF級，體質量200±20g。

2 方法

2.1 建立慢性盆腔炎模型 參考文獻方法［7－8］，用注射器分別抽取等體積的濃度為1×109cfu的大腸桿菌、金黃色葡萄球菌和解脲脲原體菌液，注入無菌培養皿中，混合均勻。將醫用明膠片剪成0.5cm×0.5cm的方塊，置于混合菌液中，使其充分接觸。明膠充分飽和后，左手持鼠尾，將大鼠倒立，右手夾含混合菌液的明膠塊經陰道塞至宮腔內，左右各1塊，并保持大鼠倒立1～2min。隔天1次，連續4次。假手術組塞入不含菌液的明膠塊。

2.2 分組及給藥 將成功建立的模型組大鼠按體質量隨機分為7組，每組10只。婦科千金片組高、中、低劑量分別按2.08，1.04和0.52g·kg－1ig給予相應質量濃度的藥液，婦炎康組按0.41g·kg－1給予婦炎康藥液，空白對照組、假手術組及模型組分別給予等容積蒸餾水，ig給藥，1次·d－1，連續21d。

2.3 大鼠慢性盆腔炎模型卵巢組織中caspase－3和caspase－8表達情況測定 解剖大鼠，取大鼠卵巢組織，用體積分數10%中性甲醛固定，常規石蠟包埋、切片。利用免疫組織化學法檢測卵巢組織caspase－3和caspase－8表達情況。

2.4 統計學分析 采用SPSS17.0軟件進行數據統計，數據均以±s表示，進行方差齊性檢驗，呈正態分布，采用單因素方差分析；呈非正態分布，則采用秩和檢驗（P＜0.05表示差異具有統計學意義，P＜0.01表示差異具有高度統計學意義）。

3 結果

3.1 婦科千金片對大鼠慢性盆腔炎模型卵巢組織caspase－3表達情況 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織caspase－3蛋白表達有非常顯著性差異（P＜0.01）。經婦科千金片治療后，與模型組相比，婦科千金片低劑量caspase－3蛋白有顯著性升高（P＜0.05），婦科千金片中、高劑量組caspase－3蛋白的表達也有非常顯著性升高（P＜0.01）。見表1和圖1。

3.2 婦科千金片對大鼠慢性盆腔炎模型卵巢組織caspase－8表達情況 與空白組比較，模型組大鼠卵巢組織caspase－8蛋白表達有非常顯著性差異（P＜0.01）。經婦科千金片治療后，與模型組相比，婦科千金片低、中、高劑量組caspase－8蛋白的表達有非常顯著性升高（P＜0.01）。見表1和圖2。

表1 婦科千金片對caspase－3和caspase－8蛋白光密度的影響Tab.1 The influence of Fuke Qianjin Tablets to caspase－3and caspase－8expression（±s，n＝10）

表1 婦科千金片對caspase－3和caspase－8蛋白光密度的影響Tab.1 The influence of Fuke Qianjin Tablets to caspase－3and caspase－8expression（±s，n＝10）

注：與空白組相比▲P＜0.05，▲▲P＜0.01；與模型組相比★P＜0.05，★★P＜0.01

組別 劑量／g·kg－1 caspase－8 AOD空白組 － 17.60±2.76★★15.40±3.75 caspase－3 AOD★★25.50±2.83假手術組 － 18.50±3.87★★15.90±3.97★★模型組 － 26.20±5.16▲▲22.10±2.88▲▲婦科千金片低劑量組 0.52 31.90±3.45★ 28.70±4.47★★婦科千金片中劑量組 1.04 34.20±4.32★★30.80±5.03★★婦科千金片高劑量組 2.08 35.00±1.89★★31.40±5.60★★婦炎康組 0.41 32.10±3.21★

4 討論

半胱氨酸天冬氨酸特異性蛋白酶（cysteinyl aspartate specific protease，caspase）是一類蛋白水解酶，與細胞凋亡和炎癥關系密切。其中caspase－3和caspase－8蛋白的表達有促進凋亡作用，caspase－3和caspase－8蛋白觸發炎癥細胞凋亡是促進炎癥恢復的機制之一。近年來研究發現，細胞凋亡途徑主要有內源性途徑、外源性途徑和內質網的ER通路［9］。外源性途徑有兩條，分別是Fas／Fasl信號途徑和TNFR－1信號途徑。其中TNFR－1信號途徑是TNF與TNFR－1結合，下傳凋亡信號，活化caspases－8，然后激活下游的caspases－3，引起caspases級聯反應，導致細胞凋亡［10－11］。

圖1 婦科千金片對大鼠慢性盆腔炎模型卵巢組織caspases－3蛋白表達的影響（×400）A.空白組；B.模型組；C.婦科千金片高劑量組Fig.1 The influence of Fuke Qianjin Tablets to rat′s caspase－3 expression of ovary with chronic pelvic inflammatory disease（×400）A.control group；B.model group；C.high dosage group of Fuke Qianjin Tablets

圖2 婦科千金片對大鼠慢性盆腔炎模型卵巢組織caspases－8蛋白表達的影響（×400）A.空白組；B.模型組；C.婦科千金片高劑量組Fig.2 The influence of Fuke Qianjin Tablets to rat′s caspase－8 expression of ovary with chronic pelvic inflammatory disease（×400）A.control group；B.model group；C.high dosage group of Fuke Qianjin Tablets

近年來研究表明，T細胞的活化在慢性炎癥的發生、發展過程中發揮重要作用，而caspase－8是T細胞活化中的重要因子。T細胞活化過程中檢測到多種caspases活性。Alam［12］用抗CD3抗體刺激人外周血單核細胞，發現caspase－8被活化，同時還檢測到其下游的caspase－3的活性。Falk等［13］在實驗中也觀察到，抗CD3／CD28抗體活化T細胞時，easpase－3及caspase－8活化，且caspase－8活化在前。在本研究中，在空白組卵巢組織中caspase－3和caspase－8蛋白的光密度最低，提示caspase－3和caspase－8蛋白在正常組織中含量較少。慢性盆腔炎模型組織中caspase－3和caspase－8蛋白的光密度值明顯高于空白組，具有高度統計學意義（P＜0.01），證明caspase－3和caspase－8蛋白在炎癥反應中其表達上調，與文獻報道一致［14］。婦科千金片治療后，與模型組比，婦科千金片低、中、高劑量組caspase－3和caspase－8蛋白光密度值明顯升高，具有高度統計學意義（P＜0.01），證 明 婦 科 千 金 片 可 以 促 進 caspase－3 和caspase－8蛋白的表達。提示在慢性盆腔炎模型中，慢性炎癥由活化的T細胞介導，婦科千金片可能通過活化T細胞，進而激活caspase－8再活化caspase－3，引起caspases級聯反應，通過此途徑激發炎性細胞凋亡，使慢性炎癥吸收消散，減輕卵巢組織炎性損傷，促進卵巢炎癥恢復。由此caspases能為T細胞免疫的干預提供新的思路，并為治療慢性炎癥提供新的途徑。

［1］吳俊平.克林霉素輔助婦科千金片治療慢性盆腔炎100例臨床療效觀察［J］.北方藥學，2013，10（6）：49－50.

［2］張藝峰.婦科千金片治療慢性盆腔炎臨床療效觀察［J］.亞太傳統醫藥，2013，9（9）：154－155.

［3］袁建菱，郭建生，伍參榮，等.婦科千金片對急性盆腔炎模型大鼠血清IgA、IgG、IgM 的影響［J］.湖南中醫藥大學學報，2010，30（9）：87－88.

［4］師振予，郭建生，袁建菱，等.婦科千金片對急性盆腔炎模型大鼠外周血細胞及盆腔組織病理改變的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2011，17（21）：199－202.

［5］魯耀邦，屈金艷，郭建生，等.婦科千金片對急性盆腔炎大鼠子宮、卵巢 TNF－α、IL－2mRNA 轉錄水平的影響［J］.中成藥，2012，34（1）：29－33.

［6］師振予，郭建生，左之文，等.婦科千金片對急性盆腔炎大鼠子宮、卵巢 NF－κB、IL－6mRNA的影響［J］.中國藥理學通報，2011，27（12）：1771－1772.

［7］李鑫，郭建生，師振予，等.婦科千金片對慢性盆腔炎大鼠血清炎性細胞因子表達的影響［J］.中國實驗方劑學雜志，2013，19（10）：225－228.

［8］張三元，聞莉.大腸桿菌所致大鼠慢性盆腔炎動物模型的建立［J］.醫學研究通訊，2001，30（2）：11－14.

［9］Wada A，Tada Y，Kawamura K，et al.The effects of FasL on inflammation and tumor survival are dependent on its expression levels［J］.Cancer Gene Ther，2007，14（3）：262－267.

［10］A Gross，J M McDonnell，S J Korsmeyer.BCL－2family members and the mitochondria in apoptosis.［J］.Genes ＆development，1999，13（15）：1899－1911.

［11］Burlacu A，Regulation of apoptosis by BCL－2family proteins［J］.Cell Mol Med，2003，7（3）：249－257.

［12］Alam A，Cohen L Y，Aouad S，et a1.Early activation of caspases during T lymphocyte stimulation results in selective substrate cleav－age in nonapoptltie cells［J］.J Exp Med，1999，190（12）：1879－1890.

［13］Falk M，Ussat S，Reiling N，et al，Caspase inhibition blocks humal T cell proliferation by suppressing appropriate regulation of IL－2，CD25，and cell cycle associated proteins［J］.J Immunol，2004，173（8）：5077－5085.

［14］Jang T L，Sehaeffer A J.The role of cytokinesin prostatitis［J］.World J Urol，2003，21（1）：95－99.