大鼠在體腸循環結合頸動脈取血研究非諾貝特納米混懸劑的體內吸收

王 棟，王永祿，葉 雯，呂貝貝，韓 杰，高天嬰，李學明（南京工業大學藥學院，南京 211816）

非諾貝特（fenofibrate）為第三代氯貝丁酯類降血脂藥物，經口服吸收后，被體內脂酶水解后變成活性產物非諾貝酸而起效［1］，是臨床上常用的降脂調脂藥物之一。非諾貝特在水中幾乎不溶，所以口服吸收差，生 物 利 用 度 低［2］。 納 米 混 懸 劑 （nanosuspensions）是適用于難溶性藥物的新劑型，系將藥物顆粒粉碎到納米級后懸浮于分散介質中，從而增加藥物的溶出速率，提高生物利用度［3］。本實驗采用大鼠在體腸循環結合頸動脈取血的方法，更真實地模擬了正常的生理條件，研究了非諾貝特納米混懸劑的在體腸吸收情況，并根據藥時曲線計算其藥動學參數，以求更全面深入地揭示非諾貝特納米混懸劑在體內的腸吸收過程。

1 儀器與材料

1.1 儀器 高效液相色譜儀（日本島津制作所，LC－20AT、SPD－20A）；紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限公司，TU－1901型）；恒流蠕動泵（保定蘭格恒流泵有限公司，BT00－300M型）；電子分析天平（德國賽多利斯股份公司，BP211D型）；數顯恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司，HH－4型）；醫用低速離心機（金壇市正基儀器有限公司，80－2型）；微型旋渦混合儀（上海滬西分析儀器廠，WH－2型）；高壓均質機（意大利 GEA Niro Soavi公司，NS1001L2K）；納米粒度分析儀（英國 Malvern儀器有限公司，3000HS）；高剪切乳化器（上海弗魯克流體機械制造有限公司）；恒溫磁力攪拌器（金壇市精達儀器制造廠）。

1.2 試藥 非諾貝特原料藥及對照品、非諾貝酸對照品均由徐州恩華藥業公司提供；非諾貝特納米混懸劑為自制，批號20110820；氯貝酸由上海安譜科學儀器有限公司提供，批號C11480000；泊洛沙姆188由南京威爾化工有限公司提供；PVP K30購自上海化學試劑公司；吐溫80購自上海凌峰化學試劑有限公司；酚紅購自南京奧多福尼生物科技有限公司；其余化學試劑均為分析純；三蒸水為自制。

1.3 動物 SD大鼠，雄性，體質量為250g左右，共6只。動物許可證號：SCXK（滬）2011－2010。

2 方法與結果

2.1 非諾貝特納米混懸劑的制備 將PVP K30和泊洛沙姆188溶于三蒸水中，加入非諾貝特適量，于85℃水浴中加熱至熔融狀態，再用高剪切乳化器以10 000r·min－1轉速乳化3min，置于高壓均質機中，以300和500bar循環3次，再以800bar循環12次，將得到的樣品置于冰浴中，迅速冷卻固化，即得到非諾貝特納米混懸劑［4］。

2.2 腸循環液中酚紅、非諾貝特及非諾貝酸的含量測定方法的建立

2.2.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；預柱：DIKMA（C18，10mm×4.6mm）；流動相：甲醇－水（80∶20），用磷酸調pH 至3.0；柱溫：25℃；檢測波長：286nm；流速：1.0mL·min－1；進樣量：20μL［5］。

2.2.2 溶液的配制 （1）Krebs－Ringer試液（pH 7.4，簡稱K－R試液）稱取氯化鈉7.8g、氯化鉀0.35g、無水氯化鎂0.02g、無水氯化鈣0.37g、磷酸二氫鈉0.32g、碳酸氫鈉1.37g、葡萄糖1.4g，加三蒸水溶解并稀釋至1L，即得。

（2）非諾貝特對照溶液 取非諾貝特對照品50mg，精密稱定，置于100mL量瓶中，加無水乙醇溶解稀釋至刻度，作為儲備液；精密移取儲備液20mL，置于100mL量瓶中，加0.1g·mL－1的吐溫80溶液5mL，用K－R試液稀釋至刻度。

（3）非諾貝酸對照溶液 取非諾貝酸對照品10mg，精密稱定，置于100mL量瓶中，用K－R試液溶解并稀釋至刻度，作為儲備液；精密量取5mL，置于50mL量瓶中，加K－R試液稀釋至刻度。

（4）混合對照液 精密量取非諾貝特儲備液50mL、非諾貝酸儲備液10mL，置于100mL量瓶中，精密加入0.1g·mL－1的吐溫80溶液5mL，用K－R試液稀釋刻度。

（5）空白腸循環液 取酚紅30mg，精密稱定，再稱取2.2.1中各物質，加乙醇50mL及0.1g·mL－1的吐溫80溶液50mL，用三蒸水溶解并稀釋至1L。將配制好的溶液在體循環4h，中止實驗，即得空白腸循環液。

（6）腸循環供試液 精密量取非諾貝特納米混懸液適量，用空白腸循環液稀釋至含非諾貝特約100μg·mL－1的溶液，在體循環4h后中止，即得腸循環供試液。

2.2.3 酚紅標準曲線的制備 取酚紅10mg，精密稱定，置于100mL量瓶中，用K－R試液溶解并稀釋至刻度，作為儲備液。精密移取酚紅儲備液0.1，0.15，0.2，0.25，0.3，0.35和0.4mL，置于10mL 量瓶中，用0.01mol·L－1氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，作為標準工作溶液。取上述標準工作溶液，以0.01mol·L－1氫氧化鈉溶液為空白，于558nm測定吸光度，以吸光度A為縱坐標、酚紅質量濃度C（μg·mL－1）為橫坐標進行線性回歸，回歸方程：A＝0.197 9C＋0.003 9，r＝0.999 3（n＝5）。

2.2.4 非諾貝特及非諾貝酸含量測定方法 取供試溶液5mL，以10 000r·min－1離心5min，取上清液1mL，置于10mL量瓶中，加0.01mol·L－1氫氧化鈉溶液稀釋至刻度，作為待測溶液，以0.01mol·L－1氫氧化鈉溶液為空白，于558nm測定吸光度，根據外標法計算酚紅質量濃度。另取適量上清液，經0.45μm微孔濾膜過濾后，在2.2.1條件下進樣測定，記錄色譜圖，按外標法計算腸循環液中非諾貝特和非諾貝酸的質量濃度。

2.2.5 方法專屬性 分別取2.2.2項下（1）～（6）溶液，在2.2.1條件下注入液相色譜儀，記錄色譜圖，如圖1。結果顯示，腸循環樣品液中非諾貝酸、非諾貝特的保留時間與對照品的一致，分別為5.3和12.8min。其他成分在色譜條件下不干擾測定。

圖1 非諾貝特、非諾貝酸HPLC測定色譜圖A.陰性對照液；B.非諾貝特對照液；C.非諾貝酸對照液；D.混合對照液；E.空白腸循環液；F.腸循環樣品液；1.非諾貝酸；2.非諾貝特Fig.1 HPLC chromatograms for fenofibrate and fenofibric acidA.negative sample；B.fenofibrate reference solution；C.fenofibric acid reference solution；D.reference solution with fenofibrate and fenofibric acid；E.blank circumfusion solution；F.circumfusion solution；1.fenofibric acid；2.fenofibrate

2.2.6 線性 分別精密量取混合對照液0.01，0.1，0.5，2.5和5mL，置于10mL量瓶中，分別用 K－R試液稀釋至刻度，作為標準工作溶液。取上述標準工作溶液，在2.2.1條件下進樣，以色譜峰面積A為縱坐標、溶液質量濃度C為橫坐標進行線性回歸。結果顯示，非諾貝特的回歸方程為：A＝63 218C－2 844，r＝0.999（n＝5），線性范圍為0.25～124.68μg·mL－1；非諾貝酸的回歸方程為：A＝90 819C－501.25，r＝0.999 9（n＝5），線性范圍為0.01～5.05μg·mL－1；表明二者線性均良好。

2.2.7 最低檢測限考察 分別取非諾貝特對照液、非諾貝酸對照溶液逐步稀釋，進樣測定，以信噪比約為3∶1作為檢測限，得非諾貝特及非諾貝酸的最低檢測質量濃度分別為10.0和1.01ng·mL－1。

2.2.8 精密度 取2.2.6項下非諾貝特質量濃度為0.25，12.47和124.68μg·mL－1的3份混合溶液，在2.2.1條件下分別連續進樣5次，記錄色譜圖，結果3種質量濃度下非諾貝特峰面積RSD分別為0.31%，0.05%和0.03%，非諾貝酸峰面積 RSD分別為0.84%，0.15%和0.04%。另取上述溶液置于冰箱中保存，分別在1，2，3，4和5d取樣測定，記錄色譜圖，結果3種質量濃度下非諾貝特峰面積RSD分別為0.99%，0.16%和0.10%，非諾貝酸峰面積RSD分別為2.13%，0.33%和0.12%。實驗結果表明方法日內和日間精密度均良好。

2.2.9 回收率 取混合對照品溶液1，2和3mL，分別置于10mL量瓶中，用K－R試液稀釋至刻度，作為不同質量濃度的供試溶液。在2.2.1項條件下進行測定，記錄色譜圖，分別計算非諾貝特與非諾貝酸的回收率。結果如表1所示，結果表明方法回收率良好。

2.2.10 穩定性考察 將混合對照液置于37℃水浴中，放置4h后取出，用K－R試液稀釋后在2.2.1項條件下測定，比較放置前后藥物含量變化，結果放置后非諾貝特含量為放置前的98.24%，非諾貝酸含量為放置前的99.97%。實驗結果表明在K－R試液中2種物質的穩定性均良好。

2.3 血漿藥物質量濃度測定方法的建立

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Kromasil C18柱（150mm×4.6mm，5μm）；預柱：DIKMA（C18，10mm×4.6mm）；流動相：甲醇－水（75∶25），磷酸調pH 至3.0；柱溫：25℃；檢測波長：286nm；流速：1.0mL·min－1；進樣量：50μL。

2.3.2 血漿樣品測定方法 取血漿樣品100μL，置于1.5mL離心管中，加內標溶液50μL（100μg·mL－1的氯貝酸甲醇溶液），渦旋30s，再加入200μL蛋白沉淀劑（乙腈與1mol·L－1鹽酸以95∶5配制而成），渦旋30s，再以12 000r·min－1轉速離心處理15min，取上清液作為供試溶液，照2.3.1項下色譜條件測定。

2.3.3 方法專屬性 分別配制空白血漿、空白血漿加內標、空白血漿加非諾貝酸以及大鼠體內給藥后血樣的供試溶液，在2.3.1條件下檢測，結果如圖2所示。

表1 回收率實驗結果Tab.1 The result of recovery test

圖2 方法專屬性驗證液相色譜圖A.空白血漿；B.內標；C.非諾貝酸；D.動物給藥血樣Fig.2 HPLC chromatograms of plasma to verify the method specificityA.plasma blank；B.the internal standard；C.fenofibric acid；D.blood sample

由圖2可見，內標（氯貝酸）的保留時間約為4.9min，非諾貝酸的保留時間約為8.5min。色譜峰峰形良好，血漿中內源性物質不干擾非諾貝酸的含量測定。

2.3.4 線性 取非諾貝酸對照品適量，精密稱定，用甲醇溶解并稀釋制成質量濃度約為20和200μg·mL－1的儲備液 A 和 B，分別移取儲備液 A 0.2，0.4，1和2mL，儲備液B 0.4，1，1.5和2mL，置于10mL量瓶中，用甲醇稀釋至刻度；分別取上述溶液50μL，用氮氣吹干后加入空白血漿樣品100μL，渦旋30s，照2.3.2處理得到血藥質量濃度分別為0.2，0.4，1，2，4，10，15和20μg·mL－1的標準溶液；取上述溶液，在2.3.1條件下進行測定，記錄色譜圖，以非諾貝酸峰面積Ai與內標峰峰面積As之比Ai／As對血漿非諾貝酸質量濃度C（μg·mL－1）進行線性回歸，得回歸方程：A＝0.210 5C＋0.027 8，r＝0.999 9（n＝8），表明非諾貝酸血藥質量濃度與峰面積在2～80μg·mL－1范圍內呈良好的線性關系。

2.3.5 最低檢測質量濃度 精密移取空白血漿100μL，向其中加入不同質量濃度非諾貝酸對照溶液，照2.3.2進行處理并測定，以信噪比約為3作為檢測限，結果表明最低檢測限為200ng·mL－1。

2.3.6 精密度 日內精密度 按2.3.2項下方法平行制備5份質量濃度為0.4，4和15μg·mL－1的樣品溶液，并于同日測定，記錄色譜圖。結果顯示3個質量濃度下血漿中非諾貝酸RSD值分別為6.41%，1.1%和0.16%，表明其日內精密度良好。

日間精密度 取日內精密度項下供試溶液，分別在1，2，3，4和5d取樣測定，記錄色譜圖。結果顯示，5d內非諾貝酸的RSD分別為4.65%，1.12%和0.2%，其日間精密度良好。

2.3.7 凍融穩定性實驗 取2.3.4項下質量濃度為0.4，4和15μg·mL－1的樣品溶液，置于－80℃冰箱冷藏1周，取出，用37℃水浴解凍后，測定其血藥質量濃度，并將結果與室溫放置的樣品進行比較。結果見表2。由表2可知，在室溫下以及在冰箱內冷凍保存后再復融的3種質量濃度的非諾貝酸血漿樣品測定值RSD均小于5%，表明在冷凍條件下，大鼠待測血漿樣品較為穩定，因此，待測血漿樣品在冷凍條件下保存1周不會影響實驗測定結果的準確性。

表2 凍融過程對含量測定的影響Tab.2 Stability of plasma samples in freezing conditions（n＝3）

2.4 大鼠在體腸循環結合頸動脈取血實驗

2.4.1 實驗方法 實驗前大鼠禁食24h，稱體質量后，于腹腔注射烏拉坦溶液（0.01mL·g－1）麻醉固定，在頸動脈處做好取血準備。沿腹中線打開腹腔（切口約2.5cm長），找出并結扎膽管，于實驗腸段兩端各切一小口，在切口處分別插入玻璃管并扎緊。用注射器從上切口處緩緩注入37℃的生理鹽水清洗腸管至凈。再將腸管兩端的玻璃管與蠕動泵連接形成回路。用蠕動泵將供試液以5mL·min－1流速循環10min后，調節流速為2.5mL·min－1，并立即自供試液錐形瓶中取樣5mL，作為測定零時刻腸循環液樣品，并向錐形瓶中補加酚紅液5mL。同時，從大鼠頸動脈取血1mL，置于肝素化刻度離心管中，其后每隔30min亦按同法取腸循環液（補加酚紅KR液）和血樣，循環4h后，中止實驗。腸循環樣品照2.2.4進行測定，結果以酚紅為參比進行校正，血樣照2.3.2方法處理后測定。實驗結果如表3所示。

由表3數據可知，隨著腸腔中藥物含量的逐漸減少，血中藥物質量濃度逐漸升高，從而印證了體外循環液中藥物的消失是因為吸收入血的結果。

表3 大鼠在體腸循環結合頸動脈取血中腸內藥物減少量及血藥質量濃度Tab.3 The reductions in the intestine and the concentration in plasma of fenofibrate

2.4.2 大鼠腸腔內藥物減少量與血藥質量濃度的相關性 以大鼠在體腸循環結合頸動脈取血實驗中的腸腔內藥物累計減少量為自變量（x）、血藥質量濃度為因變量（y），進行線性回歸，線性方程：y＝7×10－5x

＋0.521 9，r＝0.993 6。

3 討論

3.1 血漿藥物濃度檢測方法 本實驗參照有關文獻建立了大鼠血漿中非諾貝特降解活性代謝物非諾貝酸的HPLC檢測方法，血漿中內源物質不干擾非諾貝酸的含量測定，方法簡單快捷，專屬性強。大鼠血漿中藥物線性關系良好（r＝0.997 5，n＝8），準確度在90%～110%之間，日間和日內精密度小于10%，最低檢測限為100ng·mL－1，凍融實驗符合要求，該方法能夠滿足血漿樣品中非諾貝酸的測定要求。

3.2 動物體內吸收的研究方法 本課題中所采用的動物實驗方法為改良的腸襻法，傳統的腸襻法是將大鼠的腸腔結扎，有時需要做部位研究時，也可以分段結扎腸腔。將藥物溶液注入到腸襻中，經過一定時間的吸收后，取出腸襻，收集沖洗腸腔內腸液，測定剩余的藥物量［6］。根據藥物的減少量來了解藥物在腸腔的吸收情況。腸襻法可以考察藥物的吸收情況和部位差異，以及促進劑的促吸收效果，在實驗過程中避免破壞血液供應和淋巴流。

在體腸循環法雖然與正常的生理條件最為接近，但是實驗手術對大鼠生理特征的改變必定會影響正常的藥物體內行為。此外，在操作過程中，麻醉、背位固定的方式及連續取血等操作也經常會加速大鼠的死亡，影響血樣的正常采集和數據的完整。

鑒于體內血藥質量濃度測定與在體腸灌注法研究藥物體內吸收均存在各自的優缺點，本課題采用兩種方法相結合的方式，同時研究非諾貝特納米混懸劑在大鼠體內的腸吸收與體內藥動學過程，以求更全面深入地揭示非諾貝特納米混懸劑的體內吸收過程。實驗結果表明，大鼠在體腸循環實驗與動物整體的藥物吸收程度有較好的相關性，血藥質量濃度與腸腔中藥物減少量在相應的各個時間點分別相關，相關系數r＝0.993 6，可以判定兩者為點對點相關，相關水平最高，此時腸吸收藥量可以直接反映藥物吸收入血的程度［7］，提示在體腸循環模型可用于非諾貝特納米混懸劑的處方優化，預測非諾貝特的體內吸收情況。

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