HPLC法同時測定丹參藥材中丹酚酸B、丹參酮ⅡA含量

羅娟敏，蘇加坤，田耀偉，蔡繼寶

(江西中煙工業有限責任公司技術研發中心，江西 南昌 330096)

丹參為我國傳統名貴中藥材，是唇型科鼠尾草屬植物丹參(Salvia miltiorrhiza Bge)的干燥根及根莖，性味苦微寒，是中醫常用活血化淤中藥，俗稱“一味丹參抵四物”。具有祛淤止痛、活血通經、清心除煩等功效[1]，臨床用于治療冠心病[2]、腦血栓、肝硬化等疾病[3]。丹參含有多種成分，其中脂溶性的二萜醌類(diterpenequinones)和水溶性的酚酸類(depsides)成分被認為是丹參藥材中的主要藥理活性成分[4]。本實驗建立了可同時測定丹參中丹酚酸B、丹參酮ⅡA含量的HPLC法。

1 材料與儀器

Agilent 1100高效液相色譜系統，配DAD檢測器(Agilent公司，美國)，Milli-Q 超純水儀(Millipore公司，美國)，Waters C18色譜柱(150mm × 3.9mm，5μm)，BSA124S 天平(Sartorius)。

乙腈(色譜純，TEDIA)、甲酸(色譜純，TEDIA)、超純水、丹酚酸B標準品(中國食品藥品檢定研究院，111562-201110)、丹參酮ⅡA標準品(中國食品藥品檢定研究院，110766-200619)、丹參標準藥材(中國食品藥品檢定研究院，120923-201113)、丹參藥材分別購于某市的各大藥店及藥材市場，經江西中醫藥大學張文惠教授鑒定均為丹參藥材。

2 實驗方法

2.1 色譜條件

色譜柱:Waters C18色譜柱(150mm ×3.9mm，5μm);以乙腈為流動相A，0.3%甲酸-水溶液為流動相B，梯度洗脫0～10min 20%B～28%B，10～18min 28%B～35%B，18～22min 35%B～65%B。22～30min 65%B～65%B;流速為1mL/min;柱溫:30℃;進樣量10μL;丹酚酸B和丹參酮ⅡA的檢測波長分別為286nm、270nm。

2.2 供試品溶液制備

取丹參粉末(過三號篩)0.3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入75%甲醇50mL，稱定重量，80℃加熱回流1h，放冷，再稱定重量，用75%甲醇補足減失的重量，搖勻，濾過，取續濾液，用75%甲醇稀釋10倍，過0.22μm濾膜，即得。

2.3 對照品溶液制備

精密稱取丹酚酸B、丹參酮ⅡA對照品適量，加甲醇溶解定容后，逐級稀釋成5組不同濃度的混標溶液，其中丹酚酸 B 的 濃 度 依 次 為 0.35、0.175、0.035、0.007、0.0014mg/mL;丹參酮 Ⅱ A 的濃度依次為 0.12、0.06、0.012、0.0024、0.00048mg/mL，該 5 組混標溶液作為對照品溶液備用。

2.4 線性關系考察

精密吸取不同濃度的對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，色譜如圖1所示，分別記錄丹酚酸B、丹參酮ⅡA的峰面積，以對照品溶液濃度為橫坐標(X)、峰面積為縱坐標(Y)進行線性回歸分析。結果表明丹酚酸B在0.014～3.5mg范圍內，峰面積具有良好的線性關系，其回歸方程為:Y=4350.9X －5.714，R2=0.9996;丹參酮ⅡA 在 0.0048～1.2mg范圍內，具有良好的線性關系，其回歸方程為:Y=44744X －6.9782，R2=0.9999。

圖1 對照品溶液的HPLC圖譜

2.5 精密度試驗

精密吸取對照品溶液10μL，在“2.1”項色譜條件下，連續進樣5次，分別記錄各化合物的峰面積，丹酚酸B峰面積的RSD為0.82%，丹參酮ⅡA為1.07%。

2.6 穩定性試驗

精密吸取同一供試品溶液，在“2.1”項色譜條件下，分別在0、3、6、9、12、24h 記錄丹酚酸 B、丹參酮ⅡA 的峰面積，兩種化合物峰面積的RSD均小于1.5%，說明樣品溶液在24h內穩定性良好。

圖2 丹參提取液的HPLC圖譜

2.7 重復性試驗

精密稱取同一批樣品5份，置具塞錐形瓶中，精密稱定，按“2.2”項供試品溶液的制備方法制備，在“2.1”項色譜條件下測定，記錄丹酚酸B、丹參酮ⅡA的峰面積，代入標準曲線中計算含量，丹酚酸B的平均含量為49.89mg/g，RSD為3.16%;丹參酮ⅡA 的平均含量為 5.27mg/g，RSD為3.46%。

2.8 加樣回收試驗

精密稱取已知含量的同一批樣品6份，置具塞錐形瓶中，精密稱定，加入一定量的對照品，按“2.2”項供試品溶液的制備方法制備，在“2.1”項色譜條件下測定，丹酚酸B的平均回收率為100.54%，RSD為1.12%;丹參酮ⅡA的平均回收率為100.58%，RSD為1.68%。見表1、表2。

表2 丹參酮ⅡA加樣回收試驗結果

3 結果

分別測定了8個不同丹參藥材樣品中丹酚酸B、丹參酮ⅡA的含量，結果見表3。

表3 8個丹參藥材樣品中丹酚酸B、丹參酮ⅡA的含量

4 討論

實驗結果表明，所收集的丹參藥材均符合2010版中國藥典丹參項下以丹酚酸B(C36H30O16)計不得少于3.0%和以丹參酮ⅡA(C19H18O3)計不得少于0.2%的規定。

本法建立的可同時測定丹參中丹酚酸B及丹參酮ⅡA含量的方法簡便，重復性好，可用于丹參藥材的質量評價。

[1]國家藥典委員會.中國藥典(一部)[S].北京:中國醫藥科技出版社，2010:70-71.

[2]廖天南.丹參治療冠心病的有效成分分析及其藥理學探析[J].中醫臨床研究，2012(21):32-33.

[3]楊丹紅，葉再元，阮冰，等.丹參水溶性化合物對肝硬化藥理作用研究進展[J].浙江中醫雜志，2010，45(4):300-303.

[4]張英鋒，王燕革，馬子川，等.丹參活性化學成分的研究[J].化學世界，2009，50(10):638-640.