告達(dá)庭四乙酰半乳糖苷半合成及抗腫瘤活性研究

陶瑛妮

(浙江中醫(yī)藥大學(xué) 浙江 杭州 310000)

C21甾體苷是一類苷元為孕甾烷衍生物與2-去氧糖等形成的苷[1]，廣泛分布于薯蕷科、夾竹桃科、蘿摩科等植物中，具有調(diào)節(jié)免疫、抗衰老等活性，由于其抗腫瘤活性顯著而受到重視。甾體苷類天然產(chǎn)物結(jié)構(gòu)復(fù)雜且類型眾多，植物中各單體的含量很低，分離鑒定天然藥物中C21甾體苷工作難度大、成本高，本實(shí)驗(yàn)通過半合成的方法研究其類似物。

1 合成實(shí)驗(yàn)

1.1 儀器與試劑

Bruker DRX-400、500型核磁共振儀測(cè)定，200～300目硅膠，白首烏經(jīng)浙江省醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物所鑒定，實(shí)驗(yàn)所用試劑或溶劑按反應(yīng)要求預(yù)處理。

1.2 合成路線

告達(dá)庭苷元 I(原料提取)與 2，3，4，6-O-四乙酰基-α-D-溴代半乳糖反應(yīng)得乙酰化的半乳糖告達(dá)庭苷IV，合成路線見圖1。

1.3 告達(dá)庭苷元提取

1.3.1 總苷提取[4]和酸水解 粉碎白首烏塊根(10kg)溶于MeOH(240L)，回流，加氯仿(8L)水浴后加 n-C6H14(2L)，回流，得總苷 305g。總苷(32.4g)加 5%HCl乙醇(150mL)，回流，得酸水解物。

1.3.2 酸水解物[3]分離 40%NaOH溶液中和酸水解物，減壓濃縮，CHCl3:CH3OH=50∶1(V∶V)洗脫，得化合物I，化合物 I的1H-NMR和13C-NMR數(shù)據(jù)與文獻(xiàn)[5]報(bào)道的數(shù)據(jù)一致。

1.4 C21甾體苷合成

1.4.1 2，3，4，6-O-五乙酰基-D-半乳糖(II)合成 醋酸酐(0.525moL)、D-半乳糖粉末(0.050moL)，經(jīng)乙酰化加冰水用乙酸乙酯溶解、飽和Na2S2O3洗滌除碘，過濾，有機(jī)層用飽和NaCl洗滌，無水MgSO4干燥，過濾，回收，得白色粗品，無水EtOH重結(jié)晶，得產(chǎn)率90.2%，mp:100～102℃。

圖1 告達(dá)庭-D-四乙酰半乳糖苷合成

1.4.2 2，3，4，6-O-四乙酰基-α-D-溴代半乳糖(III)合成II(0.02mol)溶于 AcOH(63mL)，ω(HBr)=30%AcOH(50mL)，攪拌，加氯仿(200mL)萃取，有機(jī)層用飽和NaHCO3、飽飽和NaCl洗滌至中性，無水MgSO4干燥，過濾，無水乙醚重結(jié)晶得淡黃色固體，產(chǎn)率80.1%，mp:90～92℃。

1.4.3 1-告達(dá)庭-2，3，4，6-O-四乙酰基-β-D-半乳糖苷(IV)合成 I(0.497mmol)、III(0.75 mmol)、少量 CdCO3和乙腈(25mL)，冷凝回流，過濾，二氯甲烷:甲醇=50∶1(V∶V)硅膠柱中洗脫，得淡黃色無定型粉末，收率42.5%，分子式:C42H60O18。1H-NMR:1.06(3H，d，J=5.0，C5＇-H)，1.07(3H，d，J=5.0，C6＇-H)，4.58(1H，br d，J=5.86，C1＇-H)，1.07(3H，s，C19-CH3)，1.38～1.40(2H，m，C1-H)，2.09(3H，s，C18-CH3)，1.40～1.46(2H，m，C2-H)，2.20～2.29(2H，m，C11-H)，2.82～2.85(2H，m，C16-H)，2.36(3H，br s，C7＇-H)，2.31～2.35(2H，m，C7-H)，2.29(3H，s，C21-CH3)，2.26～ 2.46(1H，m，C4＇-H)，2.36～ 2.39(2H，m，C4-H)，3.88～ 3.91(1H，m，C3-H)，4.13～ 4.18(1H，m，C12-H)，5.38(1H，brs，C6-H)，5.53(1H，br s，C2＇-H)13C-NMR(ppm):113.21、118.47、140.27、166.25、167.23、169.60、170.44、170.56、170.66、209.05、100.63，其中乙酰半乳糖端基碳信號(hào) δ:100.63，端基質(zhì)子信號(hào) δ4.58 ppm(1H，br d，J=5.86Hz)，從偶合常數(shù)得知乙酰半乳糖與苷元β苷鍵連接，比較13CNMR 苷元 IV 與 I，可見 C-2(-2.0 ppm)，C-3(8.4 ppm)，C-4(-3.8 ppm)，表明糖鏈連接在苷元C-3羥基上，結(jié)合化學(xué)反應(yīng)，確證化合物為告達(dá)庭3-O-β-D-四乙酰半乳糖苷。

2 體外抗腫瘤活性實(shí)驗(yàn)

培養(yǎng)基:RPMI 1640培養(yǎng)基，含10%小牛血清;細(xì)胞株:人肺癌 A549，人前列腺癌 PC3，人肝癌 BEL-7402，人胃癌SGC-7901;測(cè)定:上述腫瘤細(xì)胞2×104個(gè)/mL接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔加細(xì)胞懸液200μL，培養(yǎng)24h加不同濃度的藥物(0.08～50 μg/mL)2μL，均設(shè)3 個(gè)孔，37℃，5%CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)48h，加5mg/mLMTT溶液10μL，培養(yǎng)4h，吸去上清液，加100μL DMSO，搖勻，酶標(biāo)儀570nm測(cè)定OD值，計(jì)算抑制率 IC50(μmol/L)。細(xì)胞株 A549、PC3、BEL-7402、SGC-790 抑制率 I(IC50):36.2、9.4、28.8、15.8;抑制率 IV(IC50):7.6、4.2、17.8、24.3;紫杉醇抑制率(IC50):0.0036、＜0.001、9.03、＜0.001。

3 結(jié)果與討論

半乳糖乙酰化、鹵代，生成III與I在CdCO3催化得IV，結(jié)構(gòu)經(jīng)1H-NMR、13C-NMR鑒定。初步藥理研究發(fā)現(xiàn) I、IV均有體外抗腫瘤活性且與紫杉醇對(duì)照活性相當(dāng)。IV對(duì)A549、PC3、BEL-7402細(xì)胞毒性作用沒I強(qiáng)，而SGC-7901細(xì)胞抑制率IV明顯高于I，可能與藥物脂水分配系數(shù)有關(guān)，推測(cè)半乳糖水溶性較大不易透過細(xì)胞膜，導(dǎo)致IV有較強(qiáng)細(xì)胞毒性作用，半合成化合物均未見文獻(xiàn)報(bào)道。

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