miR-29a抑制KLF4對血管平滑肌細胞表型轉化的影響

錢德慧，晉軍，秦浙學，劉曦，黃嵐

表型轉化是血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells，VSMCs)參與動脈粥樣硬化發生發展和新生內膜增生的分子基礎[1]。既往研究發現Krupple樣因子4(Krupple-like factor 4，KLF4)是VSMCs由收縮表型向合成表型轉化的關鍵轉錄因子[2]。血管損傷后，上調的KLF4可促進VSMCs向合成型轉化，但KLF4本身的調節機制尚不清楚[3]。研究發現，非編碼小RNA(microRNA，miRNA)在VSMCs表型轉換中發揮了重要作用[4]，筆者利用生物信息學預分析推測KLF4可能是miRNA-29a(miR-29a)的靶基因，miR-29a在KLF4調節的VSMCs表型轉化中可能扮演重要角色。本研究采用熒光素酶報告基因系統及表達調控實驗，驗證KLF4是否為miR-29a的靶基因，進而探討miR-29a在VSMCs表型轉化中的作用，從miRNA角度研究KLF4的部分上游調控機制，為動脈粥樣硬化發生發展機制的研究提供新的思路。

1 材料與方法

1.1 主要材料及試劑 2個月齡SPF級雄性SD大鼠，體重180～200g，由第三軍醫大學實驗動物中心提供；空載體質粒psilencer4.1-CMV、大腸埃希菌DH5α為本實驗室保存。胎牛血清(FBS)、DMEM/F12、G418購自美國Gibco公司；脂質體LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；熒光素酶(luciferase)報告基因系統購自Ambion公司；野生型及突變型KLF4熒光素報告基因由吉凱基因生物公司構建；抗大鼠KLF4、SM-MHC、SM-22α、calponin、GAPDH、β-tubulin抗體購自美國Santa Cruz公司；[3H]-TdR購自重慶西南醫院核醫學科。

1.2 方法

1.2.1 大鼠主動脈平滑肌細胞培養 頸椎脫臼法處死大鼠[5]，取胸腹主動脈，剔除外膜及脂肪組織，將血管縱向剖開刮除內膜后剪成組織塊，用吸管將組織塊平鋪于瓶底，37℃、5%CO2孵箱干貼壁4h后，加入含20% FBS及雙抗的DMEM/F12培養基繼續培養，并添加10ng/ml PDGF。以后每3d更換培養液1次。

1.2.2 miR-29a靶基因驗證 按轉染質粒不同分為4組：野生型KLF4+miR-29a表達質粒組、野生型KLF4+陰性表達質粒組、突變型KLF4+miR-29a表達質粒組和突變型KLF4+陰性表達質粒組。……