Akt和GLUT-4在妊娠糖尿病與孕期體重過(guò)度增長(zhǎng)孕婦脂肪組織中的表達(dá)變化

伍麗，周瑋，劉建

我國(guó)妊娠糖尿病(gestational diabetes mellitus,GDM)發(fā)病率為3%～4%，且呈逐年上升趨勢(shì)[1]。孕前肥胖尤其體重超過(guò)65kg是GDM的危險(xiǎn)因素[2]。McMahon等[3]研究發(fā)現(xiàn)，孕前體重＜49kg或＞65kg可增加GDM風(fēng)險(xiǎn)。研究證實(shí)，GDM和肥胖可引起孕婦脂肪組織及骨骼肌胰島素信號(hào)通路缺陷[4]。胰島素抵抗是GDM發(fā)病的始動(dòng)因素，是機(jī)體對(duì)胰島素效應(yīng)性降低的一種狀態(tài)，表現(xiàn)為胰島素效應(yīng)器官(肝臟、骨骼肌和脂肪)對(duì)胰島素的敏感性降低，其中脂肪組織是胰島素抵抗的始發(fā)部位[5-6]。但目前只有少數(shù)研究報(bào)道了孕期體重過(guò)度增長(zhǎng)，即體重指數(shù)(BMI)增長(zhǎng)過(guò)快、糖耐量正常婦女的胰島素信號(hào)通路變化情況，對(duì)孕期體重過(guò)度增長(zhǎng)與GDM之間關(guān)系的分子基礎(chǔ)研究還較少。本文旨在探討GDM和孕期體重過(guò)度增長(zhǎng)對(duì)胰島素信號(hào)通路的影響，分析GDM發(fā)生的分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象及分組 選擇2013年2－7月在重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院行系統(tǒng)產(chǎn)檢并剖宮產(chǎn)分娩的GDM孕婦15例(GDM組)。診斷標(biāo)準(zhǔn)為：孕24～28周行75g糖耐量試驗(yàn)(OGTT)測(cè)定，按WHO標(biāo)準(zhǔn)即空腹5.1mmol/L，1h 10.0mmol/L，2h 8.5mmol/L，其中1項(xiàng)或1項(xiàng)以上達(dá)到或超過(guò)正常值，可診斷為GDM[6]，選擇其中BMI增加約為7kg/m2、經(jīng)飲食治療使血糖控制良好者(餐后2h血糖＜6.7mmol/L)作為GDM組。選擇同期入院且糖耐量正常、BMI增加約4kg/m2，接受剖宮產(chǎn)手術(shù)的孕婦15例，作為正常孕婦(NGT1)組。選擇同期行剖宮產(chǎn)、糖耐量正常、BMI增加約8kg/m2的孕婦15例作為體重過(guò)度增長(zhǎng)(NGT2)組。所有入選病例均排除高血壓、多囊卵巢、肝腎功能異常等疾病。3組產(chǎn)婦年齡、孕周、空腹血糖(fasting blood glucose，F(xiàn)BG)、早孕期BMI等差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，NGT2組BMI的增加明顯高于NGT1組(P＜0.05，表1)。

1.2 生化指標(biāo)及檢測(cè) 采患者空腹血5ml，高速離心機(jī)4℃下4000r/min離心5min，分離血清；經(jīng)4℃下14 000r/min離心5min去除細(xì)胞碎片，上清分裝至1.5ml EP管，立即檢測(cè)FBG和空腹胰島素(fasting insulin，F(xiàn)INS)。血糖測(cè)定采用葡萄糖氧化酶法，胰島素測(cè)定采用放射免疫法。計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)(homeostatic model assessment of insulin resistance，HOMA-IR)及胰島β細(xì)胞分泌指數(shù)(homeostatic model assessment of insulin secretion index，HOMA-IS)。HOMA-IR=FBG×FINS/22.5。HOMA-IS=20×FINS/(FBG－3.5)。

表1 三組孕婦基線臨床資料比較Tab.1 Comparison of baseline data among three groups of pregnant women

1.3 脂肪組織磷酸化蛋白激酶B(Akt)及葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白4(GLUT-4)的表達(dá)檢測(cè)

1.3.1 材料準(zhǔn)備及處理 剖宮產(chǎn)手術(shù)時(shí)按無(wú)菌要求留取少量腹部皮下脂肪組織，將其移入盛有Krebs-Henseleit緩沖液的無(wú)菌培養(yǎng)皿中，剔除筋膜和小血管組織，再用Krebs-Henseleit緩沖液清洗3次，順筋膜紋路分成直徑約1mm的脂肪小團(tuán)。脂肪組織分為2份，分別置入普通Krebs-Henseleit緩沖液(基礎(chǔ)狀態(tài))以及含胰島素(1×10-7mol/L)的Krebs-Henseleit緩沖液(胰島素刺激狀態(tài))中，在37℃、95%O2、5%CO2孵箱中溫育30min后冰浴終止反應(yīng)。

1.3.2 Western blotting法檢測(cè)蛋白表達(dá) 各取兩種狀態(tài)的脂肪組織50mg，用Western細(xì)胞裂解液(碧云天公司)1ml在冰上勻漿，4℃下12 000×g離心20min，留取上清。用BCA蛋白定量試劑盒進(jìn)行蛋白定量，取50μg蛋白加5×上樣緩沖液(體積比4:1)100℃煮沸10min，行12%SDS-PAGE電泳后濕轉(zhuǎn)至PVDF膜上，用5%脫脂牛奶室溫封閉1h，按1:1000比例稀釋GLUT-4、p-Akt、t-Akt一抗(Millipore公司)，4℃過(guò)夜；TBST漂洗3次，每次5min；再按1:2500比例稀釋辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，TBST漂洗3次后用ECL化學(xué)發(fā)光劑在X線下曝光、顯影。經(jīng)Quantity One軟件分析光密度值，結(jié)果以目的蛋白條帶與內(nèi)參蛋白β-actin條帶光密度值的比值表示。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以s表示，三組間比較采用單因素分析，進(jìn)一步兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 生化指標(biāo)水平比較 NGT1組、NGT2組、GDM組空腹血糖無(wú)明顯差異(P＞0.05)；GDM組FINS、HOMA-IR、HOMA-IS均高于NGT2組，且NGT2組高于NGT1組(P＜0.05，表2)。

2.2 Akt磷酸化水平及GLUT-4蛋白表達(dá) 基礎(chǔ)狀態(tài)下的脂肪組織中，NGT1組、NGT2組、GDM組Akt的表達(dá)無(wú)明顯差異(P＞0.05)；經(jīng)胰島素刺激后，NGT1組Akt蛋白的磷酸化程度明顯增高(P＜0.05)，而NGT2組和GDM組則無(wú)明顯變化(P＞0.05)。

基礎(chǔ)狀態(tài)下的脂肪組織中，GDM組GLUT-4蛋白表達(dá)水平與NGT1組相比明顯降低(P＜0.05)，NGT2組與NGT1組相比稍有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)；經(jīng)胰島素刺激后，三個(gè)組GLUT-4蛋白表達(dá)水平與各自的基礎(chǔ)狀態(tài)相比均有所增加，NGT1組增加的幅度高于NGT2組(P＜0.05，圖1)。

表2 三組孕婦血生化指標(biāo)比較Tab.2 Comparison of blood biochemical information among three groups of pregnant women

圖1 三組脂肪組織Akt和GLUT-4蛋白表達(dá)Fig. 1 Expression of Akt and GLUT-4 in adipose tissue of three groups

3 討 論

GDM是在妊娠期首次發(fā)現(xiàn)的糖代謝異常，它的特征性標(biāo)志是胰島素抵抗，目前大部分研究支持胰島素信號(hào)通路的變化和隨后出現(xiàn)的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)異常是使糖尿病孕婦發(fā)生胰島素抵抗的潛在原因，但是發(fā)生這種現(xiàn)象的機(jī)制目前仍有待闡明[7]。

胰島素在機(jī)體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中發(fā)揮著多重作用，如通過(guò)葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白進(jìn)行葡萄糖的轉(zhuǎn)運(yùn)、糖原合成、蛋白質(zhì)合成和脂類代謝等，胰島素信號(hào)通路缺陷可使正常代謝受到影響[8]。本研究3組孕婦臨床資料和生化結(jié)果表明：NGT2組整個(gè)孕期BMI增加約為8.5kg/m2，較NGT1組明顯增高，屬于體重過(guò)度增長(zhǎng)。由于GDM組進(jìn)行了飲食控制，所以3組孕婦FBG差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。GDM組FINS、HOMA-IR和HOMA-IS最高，NGT2組次之，NGT1組最低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。這些結(jié)果提示孕期體重增長(zhǎng)過(guò)快的孕婦，雖然FBG保持穩(wěn)態(tài)，但其他糖代謝相關(guān)的生化指標(biāo)已有向GDM發(fā)展的趨勢(shì)，這可能是由于孕期肥胖使母體胰島β細(xì)胞分泌的胰島素不足以抵消胰島素敏感性進(jìn)行性下降所致，所以胰島素的靶組織之一皮下脂肪組織中出現(xiàn)胰島素信號(hào)通路障礙，發(fā)生胰島素抵抗。

PKB/Akt是一種絲氨酸/蘇氨酸激酶，參與多種細(xì)胞的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。PKB/Akt激活后，可使GLUT-4從胞質(zhì)轉(zhuǎn)移至胞膜，介導(dǎo)葡萄糖向細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)，促進(jìn)糖的吸收。張敬芳等[9]研究發(fā)現(xiàn)，2型糖尿病大鼠對(duì)胰島素刺激的反應(yīng)性降低，與正常對(duì)照組相比，其骨骼肌和肝臟胰島素刺激后的Akt活性分別下降41%和32%。本研究結(jié)果顯示：基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)，NGT1組、NGT2組、GDM組Akt的表達(dá)無(wú)明顯差異。經(jīng)胰島素刺激后，NGT1組Akt蛋白的磷酸化程度明顯增高(P＜0.05)，而NGT2組和GDM組則無(wú)明顯變化，提示NGT1組孕婦對(duì)胰島素保持應(yīng)有的敏感性，在胰島素刺激作用下，當(dāng)信號(hào)傳至Akt時(shí)，使Akt蛋白磷酸化程度增高，從而激活葡萄糖的攝取和利用等一系列生物學(xué)效應(yīng)。而GDM患者和NGT2組孕婦對(duì)胰島素的反應(yīng)性降低，表現(xiàn)為經(jīng)胰島素刺激后，Akt無(wú)法發(fā)生磷酸化而進(jìn)一步活化，即GDM組和NGT2組Akt蛋白磷酸化程度(p-Akt)較NGT1組孕婦為低，致使下游信號(hào)分子傳遞減弱，最終導(dǎo)致葡萄糖的攝取和利用減少，血糖水平升高。

Colomiere等[10]發(fā)現(xiàn)肥胖婦女的肌肉組織中GLUT-4 mRNA和蛋白表達(dá)水平明顯低于體重正常孕婦。本研究結(jié)果顯示：在基礎(chǔ)狀態(tài)(無(wú)胰島素刺激)的脂肪組織中，GDM組GLUT-4蛋白表達(dá)與NGT1組相比明顯降低，NGT2組與NGT1組相比稍有下降，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；經(jīng)胰島素刺激后，三組GLUT-4蛋白表達(dá)水平與各自基礎(chǔ)狀態(tài)比較均有增加，NGT1組增加的幅度明顯高于NGT2組。該結(jié)果提示，在基礎(chǔ)狀態(tài)時(shí)，GDM患者由于胰島素信號(hào)通路中的上游信號(hào)分子胰島素受體底物(IRS-1/IRS-2)、Akt出現(xiàn)轉(zhuǎn)錄或翻譯水平的缺陷，影響了信號(hào)傳遞[11]，而此時(shí)，NGT2組孕婦的胰島細(xì)胞處于正常狀態(tài)而出現(xiàn)代償，因而胰島素信號(hào)通路最后環(huán)節(jié)GSVS中核心分子GLUT-4沒(méi)有呈現(xiàn)明顯降低。經(jīng)胰島素刺激后，NGT1組和NGT2組與各自的基礎(chǔ)狀態(tài)相比，GLUT-4蛋白表達(dá)水平均增高，但NGT1組增加的幅度顯著大于NGT2組，再次證明體重過(guò)度增長(zhǎng)孕婦對(duì)胰島素的敏感性下降，使信號(hào)傳遞發(fā)生障礙，影響GLUT-4的表達(dá)和功能，阻礙GLUT-4從儲(chǔ)存囊泡轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞膜，從而無(wú)法發(fā)揮正常的葡萄糖轉(zhuǎn)運(yùn)作用。

綜上所述，本研究進(jìn)一步證實(shí)了GDM孕婦脂肪組織中胰島素信號(hào)通路受損，對(duì)胰島素的反應(yīng)降低，導(dǎo)致胰島素抵抗；同時(shí)也發(fā)現(xiàn)孕期體重過(guò)度增長(zhǎng)的孕婦脂肪組織中的關(guān)鍵蛋白Akt、GLUT-4有著與GDM孕婦逐漸趨于一致的表現(xiàn)。筆者推測(cè)體重過(guò)度增長(zhǎng)和GDM發(fā)生有著必然聯(lián)系，孕期胰島素敏感性的下降導(dǎo)致糖脂代謝紊亂，而代謝紊亂則進(jìn)一步加重胰島素抵抗，最終發(fā)展成為GDM。這將為加強(qiáng)孕期營(yíng)養(yǎng)指導(dǎo)，防止體重過(guò)度增加提供理論依據(jù)，并對(duì)GDM的病因?qū)W研究和母體未來(lái)2型糖尿病的發(fā)生提供進(jìn)一步的研究思路。

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