重癥中暑腸淋巴激活血管內皮細胞炎性活性的研究

童華生，段鵬凱，張興欽，安曉慶，萬鵬，唐柚青，蘇磊

新近研究認為在多種重癥疾患應激早期，腸源性毒性物質即可通過腸系膜淋巴途徑直接誘導全身炎癥反應并引起內臟器官損害[1-2]，本課題組前期研究亦發(fā)現(xiàn)重癥中暑腸淋巴可激活血管內皮細胞，引發(fā)炎癥反應，致其損傷[3]。更為重要的是目前研究已發(fā)現(xiàn)血管內皮細胞損傷是重癥中暑多臟器功能損害發(fā)病的關鍵病理生理機制，血管內皮細胞炎癥活性的激活是其中的重要環(huán)節(jié)之一，內皮細胞分泌炎性介質的同時表達相關細胞黏附分子可促進炎癥細胞的黏附、浸潤進而造成組織炎癥損傷[4-6]。本研究通過觀察重癥中暑腸淋巴對血管內皮細胞炎癥活性的影響，深入探討重癥中暑的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 重癥中暑大鼠模型制備 由于雌激素對熱損傷具有保護作用[7]，本實驗采用體重220～250g雄性Wistar大鼠，3%戊巴比妥鈉(lml/kg)腹腔注射麻醉，固定于手術臺。按照本課題組前期建立的方法制備重癥中暑動物模型[3,8]，觀察大鼠在高溫高濕環(huán)境熱暴露狀態(tài)下生命體征的變化趨勢。模型制備成功標準：持續(xù)熱暴露狀態(tài)下，動物中心體溫達42℃以上，平均動脈壓(mean arterial pressure，MAP)從峰值下降25mmHg即為發(fā)生重癥中暑[3,9]。

1.2 腸系膜淋巴液引流收集 將全腸道及網(wǎng)膜組織掀起，暴露腸系膜上動脈及腸系膜淋巴管，于近腹主動脈處剪開漿膜，鈍性分離腸系膜上動脈及腸系膜淋巴干；輕提腸系膜淋巴干，在其上用眼科剪剪一小口，待少量淋巴液流出，用眼科鑷夾持45°斜面硅膠導管于開口處順淋巴管走向緩慢送入3～7mm；用少量醫(yī)用膠涂抹于右腎旁漿膜處固定導管，分別收集熱暴露前(Pre-HS)、熱暴露期間(During-HS)和重癥中暑后(Post-HS)的大鼠腸淋巴液。

1.3 ECV-340細胞的培養(yǎng)及處理 取對數(shù)期臍靜脈內皮ECV-340細胞，用含10%胎牛血清的RPMI 1640液接種于96孔板培養(yǎng)，5×104/ml，待細胞生長至融合狀態(tài)，換無血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)12h。分別加入5% Pre-HS、During-HS和Post-HS腸淋巴液孵育3、6h，每組設6個復孔。收集細胞培養(yǎng)上清用于炎癥介質檢測。由于實驗結果發(fā)現(xiàn)熱暴露后腸淋巴孵育ECV-340細胞6h后，ECV-340細胞炎性分泌活性明顯，因此只檢測腸淋巴孵育6h時的ICAM-1 mRNA表達和NF-κB活性水平。

1.4 炎癥介質檢測 采用ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清高水平高遷移率族蛋白B1(Shino-Test Corporation，Sagamihara，HMGB1)、腫瘤壞死因子α(TNF α)、白介素1β(IL-1β)和IL-6水平，操作按說明書進行。

1.5 ICAM-1 mRNA表達檢測 采用Trizol試劑盒提取ECV-340細胞RNA，反轉錄成cDNA。細胞間黏附分子1(intercellular cell adhesion molecule 1，ICAM-1)引物：正義5'-AACTTTTCAGCTCCGGTCCTG-3'，反義5'-TCAGTGTGAATTGGACCTGCG-3'。采用PCR試劑盒擴增，反應條件：95℃ 30s，58℃ 30s，72℃ 50s，共35個循環(huán)；72℃ 8min。PCR產(chǎn)物經(jīng)1.5%瓊脂凝膠電泳，采用Image J 2.1.4.7進行圖像分析處理。

1.6 NF-κB水平檢測 采用細胞核蛋白試劑盒(江蘇碧云天)提取ECV-340細胞核蛋白，采用TransFactor Profiling Kit-Inflammation試劑盒(BD Biosciences)檢測核轉錄因子κB(NF-κB)的活性，上樣量為40μg，具體操作按說明書進行。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 15.0進行統(tǒng)計學分析，計量資料采用s表示，多組間比較采用Oneway ANOVA分析，兩組間比較采用LSD法，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結 果

2.1 重癥中暑腸淋巴誘導ECV-340細胞分泌炎癥介質 ELISA法檢測結果顯示，熱暴露前腸淋巴處理ECV-340細胞不分泌HMGB1，低水平分泌IL-6、IL-1β、TNF-α，而熱暴露后，即During-HS和Post-HS情況下腸淋巴可誘導ECV-340細胞HMGB1、IL-6、IL-1β、TNF-α分泌增加(P＜0.05或P＜0.01)，且誘導效應隨著熱暴露時間的延長而呈時間依賴性增強(P＜0.05，圖1)。

2.2 重癥中暑腸淋巴誘導ECV-340細胞ICAM-1、NF-κB表達情況 熱暴露后腸淋巴孵育6h后，ECV-340細胞ICAM-1 mRNA、NF-κB表達均增加(P＜0.05或P＜0.01)，且誘導效應隨著熱暴露時間的延長也呈時間依賴性增強(P＜0.05，圖2)。

3 討 論

腸道是眾多危重疾病病理生理過程的扳機點，高熱應激致腸源性毒素血癥是驅動重癥中暑發(fā)生發(fā)展的關鍵環(huán)節(jié)之一，而基于血管內皮損傷的病理效應是重癥中暑發(fā)生、發(fā)展的平臺。重癥中暑時腸源性毒性物質進入循環(huán)，誘導血管內皮損傷，啟動全身炎癥反應，致凝血功能紊亂，這是重癥中暑發(fā)病的根本機制[1-3]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，重癥中暑腸淋巴途徑可能是重癥中暑腸源性毒性產(chǎn)物誘導血管內皮損傷的橋梁[3]，但有關腸淋巴對血管內皮細胞炎性活性的影響，尚未見報道。

在熱應激狀態(tài)下，腸道血管收縮會導致缺血缺氧改變進而使腸黏膜通透性增加，促使腸源性毒性因子進入腸淋巴管，產(chǎn)生全身性病理損害效應[10-12]。本研究發(fā)現(xiàn)，During-HS腸淋巴可誘導ECV-340細胞呈時間依賴性分泌高水平IL-1β、IL-6、TNF-α和HMGB1，而Post-HS腸淋巴的誘導效應更為明顯，提示熱應激早期腸淋巴即可誘導血管內皮細胞釋放炎性因子，且隨著熱應激時間的延長，腸淋巴毒性效應愈為明顯。本研究也表明，血管內皮是重癥中暑炎癥反應的重要效應環(huán)節(jié)之一，這與既往研究結果一致[4-6]。早期炎癥介質IL-1β、IL-6和TNF-α可進一步激活機體組織和全身性炎癥反應，參與重癥中暑全身炎性反應的發(fā)病過程且與疾病嚴重程度密切相關[13]。

圖1 重癥中暑腸淋巴誘導ECV-340細胞炎性介質分泌的ELISA檢測Fig.1 Secretion of inflammatory mediators of ECV-340 cells induced by severe heatstroke mesenteric lymph (ELISA)

圖2 重癥中暑腸淋巴對ECV-340細胞ICAM-1、NF-κB表達的誘導作用Fig.2 Induction effect of severe heatstroke mesenteric lymph on ICAM-1 mRNA and NF-κB expression of ECV-340 cells

盡管HMGB1是一種參與膿毒癥發(fā)病的晚期炎癥介質，但其在重癥中暑動物模型的熱應激早期即可出現(xiàn)[14-16]，更為重要的是HMGB1可在體內長時間高水平存在，可能在重癥中暑持續(xù)性炎癥反應中發(fā)揮重要作用，是重癥中暑發(fā)病的關鍵性因子之一[17-18]。與腸淋巴誘導血管內皮炎性分泌效應一致的是，本研究還發(fā)現(xiàn)熱應激腸淋巴可誘導血管內皮ICAM-1 mRNA表達明顯上調。ICAM-1作為血管內皮與炎癥細胞黏附的重要分子，可能介導多種炎性細胞向組織、器官定向轉移、浸潤，參與重癥中暑炎癥的發(fā)生和發(fā)展[19]。NF-κB是細胞炎性反應的主要轉錄因子，被激活后可導致炎性細胞因子、黏附分子以及許多其他調節(jié)轉錄凋亡的基因表達，進而參與機體炎性反應[20]。已有研究表明，腸淋巴誘導血管內皮損傷是基于NF-κB途徑的[21]，但重癥中暑腸淋巴激活血管內皮炎癥效應是否通過NF-κB途徑目前尚不清楚。本研究結果發(fā)現(xiàn)，重癥中暑腸淋巴可明顯激活血管內皮NF-κB活性，且血管內皮NF-κB活性與其炎癥效應增加趨勢一致，提示重癥中暑腸淋巴激活血管內皮炎性效應可能是基于NF-κB途徑。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)，重癥中暑病程中腸淋巴可激活血管內皮炎癥效應，且這種毒性激活效應隨著熱應激時間的延長而增強，提示基于腸淋巴途徑的腸源性毒性物質和血管內皮構成了重癥中暑的關鍵發(fā)病環(huán)節(jié)，NF-κB可能參與了熱應激腸淋巴激活血管內皮炎癥效應的分子通路，但仍需進一步研究證實。

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