PCNA對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡和增殖的影響

趙莉琳，劉陽

口腔癌是臨床常見的惡性腫瘤之一，全球每年新增口腔癌患者約10萬人[1]。絕大多數(shù)口腔癌為口腔鱗癌(oral squamous cell carcinoma，OSCC)，惡性程度較高，治療主要以手術(shù)、放化療相結(jié)合的綜合治療為主，患者的5年生存率僅為50%[2]。近年來，靶向藥物設(shè)計(jì)從多個(gè)信號(hào)途徑對(duì)腫瘤進(jìn)行抑制，已成為研究的熱點(diǎn)，因此，對(duì)口腔鱗癌進(jìn)行深入研究，尋找更多的潛在靶點(diǎn)十分必要[3-4]。增殖細(xì)胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)只存在于正常增殖細(xì)胞以及腫瘤細(xì)胞內(nèi)，與細(xì)胞DNA合成密切相關(guān)，對(duì)細(xì)胞增殖起重要作用[5-6]，是細(xì)胞異常增殖的關(guān)鍵蛋白。近年來，PCNA與腫瘤發(fā)生發(fā)展的關(guān)系逐漸成為研究熱點(diǎn)[7]。PCNA基因在很多腫瘤中高表達(dá)，包括胃癌、肝癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、膀胱癌以及肺癌等[8-10]。李向新等[11]對(duì)48例口腔鱗癌組織以及正常口腔黏膜中PCNA蛋白的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，PCNA在48例口腔鱗癌中均有不同程度表達(dá)，而在正常口腔黏膜細(xì)胞中均為表達(dá)陰性，提示PCNA可能在口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展中起重要作用。阿達(dá)萊提等[12]也報(bào)道了同樣的發(fā)現(xiàn)。本研究通過增強(qiáng)或者抑制PCNA在口腔鱗癌TCA8113細(xì)胞中的表達(dá)，探討了PCNA基因在TCA8113細(xì)胞系凋亡和增殖中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑 人口腔鱗癌細(xì)胞株TCA8113、低表達(dá)載體pSilencer、高表達(dá)載體pcDNA3.1由本室保存，RPMI 1640，胎牛血清、Trizol、Lipofectamine 2000、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司。Myc抗體購自北京全式金生物技術(shù)有限公司，兔抗鼠二抗購自北京中杉金橋公司。限制性內(nèi)切酶、Taq酶等常用試劑購自日本TaKaRa公司或全式金生物技術(shù)有限公司。引物合成、測(cè)序在上海生工生物工程公司進(jìn)行。四甲基偶氮唑藍(lán)(MTT)購自美國Sigma公司，順鉑購于山東齊魯制藥廠，使用濃度為4μg/ml。實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒為全式金生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品，凋亡檢測(cè)試劑盒購自深圳晶美生物工程有限公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng) 人口腔鱗癌TCA8113細(xì)胞株在37℃、5%CO2條件下，用含有10%胎牛血清、100U/ml青霉素、100μg/ml鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)。

1.3 質(zhì)粒構(gòu)建 質(zhì)粒構(gòu)建按常規(guī)操作。設(shè)計(jì)合成特異性PCNA引物，從cDNA模板中PCR克隆出PCNA基因CDS全長(zhǎng)，經(jīng)過酶切、連接，構(gòu)建成功pcDNA3.1-PCNA高表達(dá)載體，重組載體融合Myc標(biāo)簽，可用Anti-Myc抗體檢測(cè)。RNA干涉采用文獻(xiàn)設(shè)計(jì)的小發(fā)夾RNA序列[13]，shPCNA靶序列為：正義5'-CAGACAAGTAATGTCGATAAA-3'，反義5'-TTTATCGACATTACTTGTCTG-3'。按要求合成序列，克隆入pSilencer載體，構(gòu)建pSilencer-shPCNA干涉載體。所有實(shí)驗(yàn)用載體均經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證。

1.4 Western blotting檢測(cè)PCNA高表達(dá) 將構(gòu)建的pcDNA3.1-PCNA重組載體轉(zhuǎn)染TCA8113細(xì)胞，轉(zhuǎn)染48h后收集細(xì)胞行Western blotting檢測(cè)。按照要求制備樣品，加入電泳緩沖液，配制聚丙烯酰胺凝膠(SDS-PAGE)，上樣電泳，轉(zhuǎn)膜。取出PVDF膜后進(jìn)行抗體孵育，采用化學(xué)發(fā)光底物檢測(cè)。以pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染作為對(duì)照組。

1.5 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 制備cDNA模板，按照試劑盒說明書進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)。PCNA：正義5'-AAGCCGAAACCAGCTAGACTTTC-3'，反義5'-TGGCGGAGTGGCAACAA-3'；Actin：正義5'-AGGCCAACCGTGAAAAGATG-3'，反義5'-ACCAGAGGCATACAGGGACAA-3'。將熒光染料SYBR Green與目的基因PCNA和內(nèi)參Actin的引物混勻，放入實(shí)時(shí)PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，測(cè)定PCNA mRNA表達(dá)的Ct值，計(jì)算mRNA的相對(duì)表達(dá)量[14]。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測(cè) 將pcDNA3.1-PCNA(高表達(dá))或pSilencer-shPCNA(沉默)轉(zhuǎn)染TCA8113細(xì)胞，48h后收集細(xì)胞，采用Annexin V/PI染色，流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。按照說明書進(jìn)行操作，首先收集細(xì)胞并洗滌制備樣品，將細(xì)胞與Annexin V試劑孵育，冰上反應(yīng)30min，臨檢測(cè)前加入5μl碘化丙啶(propidium iodide，PI)，立即上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。以pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染作為對(duì)照組，pcDNA3.1-PCNA或pSilencer-shPCNA轉(zhuǎn)染為實(shí)驗(yàn)組，重復(fù)3次。同樣另設(shè)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后加入4μg/ml順鉑處理，即可檢測(cè)PCNA對(duì)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響。

1.7 細(xì)胞增殖檢測(cè) 將TCA8113細(xì)胞接種于96孔板，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PCNA重組載體或pcDNA3.1空載體(各設(shè)4孔)，分別于轉(zhuǎn)染24、48、72、96h后，每孔加入10μl MTT儲(chǔ)液(10mg/ml)，37℃培養(yǎng)4h，小心吸出孔內(nèi)培養(yǎng)液，每孔加入150μl DMSO，酶標(biāo)儀檢測(cè)A490值。實(shí)驗(yàn)組存活率=(實(shí)驗(yàn)組A490/對(duì)照組A490)×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。pSilencer-shPCNA轉(zhuǎn)染做類似處理。實(shí)驗(yàn)以pcDNA3.1空載體轉(zhuǎn)染作為對(duì)照組，pcDNA3.1-PCNA或pSilencer-shPCNA轉(zhuǎn)染為實(shí)驗(yàn)組。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，數(shù)據(jù)結(jié)果以s表示，同一時(shí)間點(diǎn)對(duì)照組和實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞凋亡率(或存活率)比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PCNA載體后PCNA基因的表達(dá)情況 通過Anti-Myc抗體檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1空載體的對(duì)照組未檢測(cè)到PCNA表達(dá)，轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PCNA的實(shí)驗(yàn)組中檢測(cè)到PCNA高表達(dá)(圖1)。

2.2 轉(zhuǎn)染pSilencer-shPCNA載體后PCNA基因mRNA的表達(dá) TCA8113細(xì)胞轉(zhuǎn)染pSilencershPCNA后48h，其mRNA水平(35.7%±10.0%)明顯低于對(duì)照組(轉(zhuǎn)染pSilencer空載體)的mRNA水平(93.3%±14.0%，P=0.006)。

圖1 轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-PCNA高表達(dá)載體后PCNA基因的表達(dá)Fig.1 PCNA gene expression after transfection by hyper expressed pcDNA3.1-PCNA

2.3 PCNA基因高表達(dá)對(duì)TCA8113細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M細(xì)胞的存活率逐漸增高，對(duì)照組24、48、72、96h細(xì)胞存活率分別為45.1%±2.2%、52.1%±2.3%、60.2%±3.1%、69.4%±2.8%，實(shí)驗(yàn)組24、48、72、96h細(xì)胞存活率分別為49.7%±1.5%、64.2%±2.9%、68.8%±2.6%、74.4%±2.5%，除96h外，兩組同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)間比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖2)。

圖2 PCNA基因高表達(dá)對(duì)TCA8113細(xì)胞存活率的影響Fig.2 Effect of hyper expression of PCNA on survival of TCA8113 cells

2.4 PCNA基因沉默對(duì)TCA8113細(xì)胞增殖的影響MTT檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著時(shí)間延長(zhǎng)，實(shí)驗(yàn)組或?qū)φ战M的細(xì)胞存活率逐漸增高，對(duì)照組24、48、72、96h細(xì)胞存活率分別為48.5%±2.1%、58.2%±2.3%、65.6%±3.5%、70.4%±2.5%，PCNA沉默組24、48、72、96h細(xì)胞存活率分別為43.1%±1.4%、50.2±1.5%、55.8±2.1%、63.4±2.4%，兩組同一個(gè)時(shí)間點(diǎn)間比較差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05，圖3)。

2.5 PCNA基因高表達(dá)對(duì)順鉑誘導(dǎo)TCA8113細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，未用順鉑處理的情況下，對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為13%，而PCNA高表達(dá)后細(xì)胞凋亡率明顯降低(7%，P=0.030)；應(yīng)用順鉑處理的情況下，PCNA高表達(dá)組的TCA8113細(xì)胞凋亡率(16%)亦明顯低于對(duì)照組(41%，P=0.011，圖4)。

圖3 PCNA基因沉默對(duì)TCA8113細(xì)胞存活率的影響Fig.3 Effect of PCNA silence on survival of TCA8113 cells

圖4 PCNA基因高表達(dá)對(duì)順鉑誘導(dǎo)的TCA8113細(xì)胞凋亡的抑制作用Fig.4 Inhibition effect of PCNA hyper expression on apoptosis of TCA8113 cells induced by cisplatin

2.6 PCNA基因沉默對(duì)順鉑誘導(dǎo)TCA8113細(xì)胞凋亡的影響 流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示，無順鉑處理的情況下，PCNA沉默后細(xì)胞凋亡率(24%)與對(duì)照組(15%)比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.248)；采用順鉑處理后，PCNA沉默組TCA8113細(xì)胞凋亡率(66%)明顯高于對(duì)照組(36%，P=0.001，圖5)。

圖5 PCNA基因沉默對(duì)順鉑誘導(dǎo)的TCA8113細(xì)胞凋亡的促進(jìn)作用Fig.5 Promotion effect of PCNA silence on apoptosis of TCA8113 cells induced by cisplatin

3 討 論

PCNA基因是人DNA復(fù)制復(fù)合體的核心組分，具有特殊的環(huán)狀結(jié)構(gòu)，可推動(dòng)DNA復(fù)制，且PCNA基因能夠與多種細(xì)胞內(nèi)分子結(jié)合，參與細(xì)胞周期調(diào)控、DNA損傷修復(fù)、DNA甲基化、染色體重塑等多種重要功能[5,15]。此外，PCNA與細(xì)胞凋亡及增殖密切相關(guān)，已有多項(xiàng)研究報(bào)道PCNA在腫瘤如胃癌、肺癌、結(jié)直腸癌、胰腺癌以及多種婦科腫瘤中呈高表達(dá)[8-9]。PCNA的異常表達(dá)與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，可用于評(píng)估腫瘤的惡性程度及增殖潛能，且在不同時(shí)期的腫瘤中具有不同的表達(dá)水平[8]。最近有多篇文獻(xiàn)報(bào)道了PCNA在口腔鱗癌中呈異常表達(dá)，而在正常口腔黏膜細(xì)胞中不表達(dá)[11-12]，推測(cè)PCNA基因可能與口腔鱗癌的發(fā)生發(fā)展有關(guān)，對(duì)其進(jìn)行研究可加深對(duì)PCNA基因本身以及口腔鱗癌的理解，并且PCNA可能作為口腔鱗癌治療的一個(gè)潛在靶點(diǎn)[3,16]。

本研究以TCA8113口腔鱗癌細(xì)胞作為研究對(duì)象，構(gòu)建pcDNA3.1-PCNA高表達(dá)載體和pSilencershPCNA基因沉默載體，通過基因轉(zhuǎn)染高表達(dá)PCNA或者沉默PCNA基因，再檢測(cè)分析PCNA對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響。我們采用Western blotting檢測(cè)驗(yàn)證了高表達(dá)的有效性，同時(shí)，采用熒光定量PCR結(jié)果驗(yàn)證了基因沉默的有效性，轉(zhuǎn)染pSilencer-shPCNA的實(shí)驗(yàn)組PCNA mRNA表達(dá)水平顯著下調(diào)。

腫瘤的發(fā)生源于細(xì)胞的異常增殖，本研究利用PCNA高表達(dá)或基因沉默，進(jìn)一步檢測(cè)PCNA基因?qū)CA8113細(xì)胞增殖的影響。MTT實(shí)驗(yàn)是檢測(cè)細(xì)胞增殖的常用方法，本研究設(shè)置了不同的時(shí)間點(diǎn)，通過MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)PCNA基因高表達(dá)可促進(jìn)TCA8113細(xì)胞的增殖(P＜0.05)，而沉默PCNA基因可抑制TCA8113細(xì)胞的增殖(P＜0.05)。為了進(jìn)一步驗(yàn)證PCNA基因與口腔鱗癌發(fā)生發(fā)展的關(guān)系，并探討其初步機(jī)制，本研究采用Annexin V/PI染色法檢測(cè)了PCNA高表達(dá)和低表達(dá)對(duì)細(xì)胞凋亡的影響，結(jié)果顯示在TCA8113細(xì)胞凋亡過程中，PCNA高表達(dá)抑制了凋亡(對(duì)照組細(xì)胞凋亡率為13%，PCNA高表達(dá)后細(xì)胞凋亡率降低到7%)，而PCNA沉默則促進(jìn)了凋亡(PCNA沉默后細(xì)胞凋亡率為24%，對(duì)照組的細(xì)胞凋亡率為15%)。因此，推測(cè)PCNA基因的異常表達(dá)與口腔鱗癌細(xì)胞系的增殖有關(guān)。

化療藥物可殺傷腫瘤細(xì)胞，是目前治療腫瘤的主要手段之一。近來的研究表明，化療藥物主要作用于腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)的不同環(huán)節(jié)上(抑制增殖或直接誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡)[17-18]，但是腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生耐藥性也是目前亟待解決的難題。文獻(xiàn)報(bào)道PCNA基因在口腔鱗癌中高表達(dá)，而在正常的口腔黏膜細(xì)胞中不表達(dá)[11-12]，本研究也證實(shí)PCNA基因參與了TCA8113口腔鱗癌細(xì)胞的增殖和凋亡通路。因此，我們?cè)O(shè)想PCNA基因可能作為腫瘤治療的潛在靶點(diǎn)，可以通過干擾PCNA基因的表達(dá)來影響其凋亡或增殖通路，從而增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對(duì)化療藥物的敏感性，提高治療效果[3,16]。順鉑是常用的化療藥物，本研究采用順鉑來誘導(dǎo)口腔鱗癌細(xì)胞凋亡，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在順鉑誘導(dǎo)TCA8113細(xì)胞凋亡的過程中，PCNA高表達(dá)可抑制凋亡(對(duì)照組凋亡率為41%，PCNA高表達(dá)組為16%)，而PCNA沉默可促進(jìn)凋亡(對(duì)照組凋亡率為36%，PCNA沉默組為66%)，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)，該結(jié)果證實(shí)干擾PCNA基因可增強(qiáng)順鉑對(duì)口腔鱗癌細(xì)胞的殺傷效果，初步表明PCNA基因作為潛在靶點(diǎn)是可行的，但仍需進(jìn)一步深入研究。

[1]Bose P, Brockton NT, Dort JC. Head and neck cancer: from anatomy to biology[J]. Int J Cancer, 2013, 133(9): 2013-2023.

[2]da Silva SD, Ferlito A, Takes RP, et al. Advances and applications of oral cancer basic research[J]. Oral Oncol, 2011, 47(9): 783-791.

[3]Le Tourneau C, Siu LL. Molecular-targeted therapies in the treatment of squamous cell carcinomas of the head and neck[J].Curr Opin Oncol, 2008, 20(3): 256-263.

[4]Khan Z, Bisen PS. Oncoapoptotic signaling and deregulated target genes in cancers: special reference to oral cancer[J].Biochim Biophys Acta, 2013, 1836(1): 123-145.

[5]Maga G, Hubscher U. Proliferating cell nuclear antigen (PCNA):a dancer with many partners[J]. J Cell Sci, 2003, 116(Pt 15):3051-3060.

[6]Liu XH, Zhang Y. Expression and significance of C-fos and proliferating cell nuclear antigen in the small intestinal tissue of human fetus[J]. Med J Chin PLA, 2011, 36(2): 145-148. [劉學(xué)紅, 張泳. C-fos和增殖細(xì)胞核抗原在人胎小腸組織中的表達(dá)及意義[J]. 解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 36(2): 145-148.]

[7]Naryzhny SN. Proliferating cell nuclear antigen: a proteomics view[J]. Cell Mol Life Sci, 2008, 65(23): 3789-3808.

[8]Li B, Chen L. Relationship between gastric cancer and the expressions of IL-6, IL-6 receptor and proliferating cell nuclear antigen[J]. Med J Chin PLA, 2007, 32(7): 710-712. [李冰, 陳凜. IL-6、IL-6R及PCNA的表達(dá)與胃癌的臨床關(guān)系研究[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 32(7): 710-712.]

[9]Setia S, Sanyal SN. Downregulation of NF-κB and PCNA in the regulatory pathways of apoptosis by cyclooxygenase-2 inhibitors in experimental lung cancer[J]. Mol Cell Biochem, 2012, 369(1-2): 75-86.

[10]Gao L, Wang GF, Ji XD, et al. Expression of NF-κB p65 and PCNA during oral leukoplakia carcino-genesis[J]. J Zhengzhou Univ (Med Sci), 2009, 44(3): 582-585. [高黎, 王國芳, 季旭東,等. 口腔黏膜白斑及鱗癌組織中核因子-JB p65與PCNA的表達(dá)[J]. 鄭州大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版), 2009, 44(3): 582-585.]

[11]Li XX, Jiang L, Bai L, et al. Expression and clinical significance of Livin and PCNA in oral squamous cell carcinoma[J]. J Pract Stomatol, 2011, 27(4): 562-565. [李向新, 蔣蕾, 白玲, 等. Livin和PCNA在口腔鱗癌中的表達(dá)及意義[J]. 實(shí)用口腔醫(yī)學(xué)雜志, 2011, 27(04) : 562-565.]

[12]Ada Eli Te, Patimem, Lu XM, et al. The expression of p53 and PCNA in Oral squamous cell carcinoma and immunohistochemical analysis of S-100 positive dendritic cell infiltration[J]. Acta Acad Med Xinjiang, 1996, 19(4): 289-293. [阿達(dá)萊提, 帕提曼, 盧曉梅, 等. 口腔鱗狀細(xì)胞癌p53、PCNA表達(dá)及S-100陽性樹突狀細(xì)胞浸潤(rùn)的免疫組化定量分析[J]. 新疆醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 1996, 19(4): 289-293.]

[13]Gong BF, Yan CY, Experimental study of suppressing effect of siRNA and shRNA targeting PCNA gene on growth of bladder cancer in vitro and in vivo[D]. China Doctoral Dissertations Full-Text Database, 2009. 46-51. [貢冰峰, 嚴(yán)春寅, 靶向PCNA基因的siRNA和shRNA抑制膀胱癌生長(zhǎng)的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究[D].中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫, 2009, 46-51.]

[14]Gao HL, Ouyang GL, Huang XX, et al. Effect of Bushen Qianggu decoction on the proliferation of synovial fibroblasts and expression of PCNA and Bcl-2[J]. Chin J Orthop Traumatol,2012, 25(11): 942-945. [高華利, 歐陽桂林, 黃新星, 等. 補(bǔ)腎強(qiáng)骨方含藥血清對(duì)滑膜成纖維細(xì)胞增殖及PCNA和Bcl-2表達(dá)的影響[J]. 中國骨傷, 2012, 25(11): 942-945.]

[15]Song LM, San JL, Xu H. The molecular structure and biological functional progress of proliferating cell nuclear antigen(PCNA)[J]. Prog Nat Sci, 2006, 16(10): 1201-1209. [宋楠萌, 桑建利,徐恒. 增殖細(xì)胞核抗原(PCNA)的分子結(jié)構(gòu)及其生物學(xué)功能研究進(jìn)展[J]. 自然科學(xué)進(jìn)展, 2006, 16(10): 1201-1209.]

[16]Zhao H, Lo YH, Ma L, et al. Targeting tyrosine phosphorylation of PCNA inhibits prostate cancer growth[J]. Mol Cancer Ther,2011, 10(1): 29-36.

[17]Shortt J, Johnstone RW. Oncogenes in cell survival and cell death[J]. Cold Spring Harb Perspect Biol, 2012, 4(12): a009829.

[18]Liu DQ. Progress in the treatment of tumor[J]. Med J Chin PLA,2007, 32(7): 661-663. [劉端祺. 關(guān)注腫瘤治療的新進(jìn)展[J].解放軍醫(yī)學(xué)雜志, 2007, 32(7): 661-663.]