10個全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥家系的SCN1A基因突變篩查研究

吳光聲，高峰，沈征，毛姍姍，沈玨，袁哲峰，李珊

全面性癲癇伴熱性驚厥附加癥(generalized epilepsy with febrile seizures plus, GEFS+)是一種常見的在兒童期發病的家族性遺傳性癲癇綜合征。自1997年Scheffer與Berkovic[1]首次報道以來，GEFS+越來越受到醫學界的關注并作為一種新的綜合征在2001年被國際抗癲癇聯盟(International League Against Epilepsy)列入癲癇綜合征分類[2]中。目前，研究主要集中在此病的致病基因上[3]，已證實的相關致病基因有5種離子通道蛋白亞單位，分別為編碼電壓門控鈉離子α1、α2、β1亞單位的SCN1A、SCN2A、SCN1B基因與編碼配體門控氯離子通道GABAA受體γ2、δ亞單位的GABRG2、GABRD基因。本研究將對收集到的10個GEFS+家系進行臨床表型分析及SCN1A基因研究，探討SCN1A基因在我國GEFS+家系中的突變情況。

1 資料與方法

1.1 研究對象 搜集2011年3月－2013年8月在浙江大學醫學院附屬兒童醫院神經科門診及住院的10個GEFS+家系，對每個家系受累成員均建立臨床登記表，內容包括姓名、性別、出生日期、民族、發病年齡、發作時表現、圍產期情況、既往史、家族史、用藥史及輔助檢查結果。另取50例正常兒童用于進行測序對照。

1.2 家系成員表型分析 根據ILAE 2010年癲癇發作與癲癇綜合征分類標準[4]，對所有先證者及家系其他受累成員的臨床表現、腦電圖及頭顱影像學資料進行分析，繪制家系圖。

1.3 SCN1A基因突變篩查 采用DNA直接測序法。應用SeqmanTM軟件對測序結果與SCN1A正常序列進行比對，當突變點在尾部、雜峰較多、信號偏低時給予反向引物進行測序驗證。正常序列為GenBank中SCN1A全基因組序列(NC_000002)，編碼區序列(CDS-AB093548)，蛋白質序列(P35498)。如發現SCN1A基因編碼區異常，則對50例正常對照及患兒家系成員相應片段進行測序、比對，以排除單核苷酸多態性(SNP)并確定突變來源。

2 結 果

2.1 一般情況 10個家系共有33例受累者，每個家系受累人數不等。受累者的臨床表型包括熱性驚厥(febrile seizures，FS)11例(33.3%)，熱性驚厥附加癥(febrile seizures plus，FS+)11例(33.3%)，FS或FS+伴部分性發作1例(3.0%)，無熱全面強直陣攣發作(afebrile generalized tonic-clonic seizures，AGTCS)3例(9.1%)，Dravet綜合征1例(3.0%)，兒童失神癲癇1例(3.0%)，發作分類不能明確5例(15.2%)。

2.2 SCN1A基因突變篩查結果 10個GEFS+家系先證者中，3例先證者存在SCN1A基因突變。進一步分析了他們所在家系成員的SCN1A基因，以明確其突變來源。

家系1先證者，男，4歲8個月，11個月大時首次出現發熱伴抽搐，11個月－3歲共發作熱性驚厥10余次，3歲1個月出現無熱抽搐，發作類型為AGTCS，每次發作持續2～5min，常在運動或勞累后發作，近1年共發作5次。其家系中共有6位受累者，先證者外公(Ⅰ-1)FS、母親(Ⅱ-2)FS+、姨媽(Ⅱ-7)FS+、姐姐(Ⅲ-2)FS、表哥(Ⅲ-7)AGTCS(圖1A)。SCN1A基因突變篩查結果(圖1B)顯示，在先證者第23外顯子發現雜合突變c.4330G＞A，遺傳密碼子由GAA變成AAA，導致1444位谷氨酸被賴氨酸取代，該突變為錯義突變。該家系5個受累者的SCN1A基因存在與先證者完全相同的基因突變，而先證者未受累的兩個姨媽(Ⅱ-3，Ⅱ-5)和其表姐(Ⅲ-3)，表哥(Ⅲ-4)未在該位點發現突變(圖1B)。

圖1 家系1的家系圖及SCN1A基因測序結果Fig. 1 Pedigree of family 1 sequencing results of SCN1A gene

家系2(圖2)：先證者，男，8歲7個月。1歲時首次出現發熱伴抽搐，1－7歲間有熱驚厥，每年發作2～3次，7歲2個月出現無熱抽搐，發作類型為AGTCS，2011年11月起開始口服丙戊酸鈉緩釋片0.25g/次，2次/d，此后未再發作驚厥。其家系中共有6個受累者，先證者奶奶(Ⅰ-2)表型為FS+、姨媽(Ⅱ-15)FS、堂哥(Ⅲ-3)FS+、堂弟(Ⅲ-4)FS、表姐(Ⅲ-7)FS+、表弟(Ⅲ-11)AGTCS、表弟(Ⅲ-17)FS+(圖2A)。SCN1A基因突變篩查結果(圖2B)顯示，在先證者第15外顯子發現雜合突變(c.2592G＞A)，遺傳密碼子由ACG變成ACA，為同義突變。先證者母親的SCN1A基因存在與先證者完全相同的基因突變，父親的SCN1A基因未發現突變。家系中其他成員血樣未能獲得。

圖2 家系2的家系圖及SCN1A基因測序結果Fig. 2 Pedigree of family 2 sequencing results of SCN1A gene

家系3先證者，男，3歲1個月時首次出現發熱伴抽搐，發作類型FS，其家系中共有2個受累者，先證者母親(Ⅱ-3)，姨媽(Ⅱ-2)表型為FS+(圖3A)。SCN1A基因突變篩查結果(圖3B)顯示，在先證者第9外顯子(c.1212G＞A)和26外顯子(c.5385 G＞A)的突變為同義突變。家系中其他成員血樣未能獲得。

圖3 家系3的家系圖及SCN1A基因測序結果Fig. 3 Pedigree of family 3 sequencing results of SCN1A gene

3 討 論

SCN1A基因為GEFS+家系的重要致病基因，為常染色體顯性遺傳，研究報道具有外顯率不全等特點(外顯率為60%～70%)[5]。本研究中，家系1中全部受累者均存在SCN1A基因突變，未受累者中未發現SCN1A突變情況，外顯率達100%，但本研究中有一些家系成員的標本未采集全，可能對結果有所影響。雖然同樣是受累者，但患者的臨床表型譜多樣，即使同一家系受累成員亦可有多種不同表型。常見的臨床表型有熱性驚厥(FS)[6-7]、熱性驚厥附加癥(FS+)，FS/FS+伴其他全身性發作(如失神、肌陣攣和失張力發作等)，其他少見如無熱強直陣攣發作、少年肌陣攣癲癇(JME)，MAE和Dravet綜合征。本研究的家系中未見Doose綜合征或Dravet綜合征等癲癇性腦病的表型。分析原因可能是因為這些表型少見，并且家系中也有多名受累者無法獲得詳細臨床資料，所以無法進行臨床分型有關。

SCN1A基因是與癲癇發病相關最重要的基因之一，與其突變引起的常見癲癇綜合征有Dravet綜合征、GEFS+，其他少見的如Doose綜合征、West綜合征、Lennox-Gastaut綜合征等[8-9]。研究報道Dravet綜合征患兒中，80%存在SCN1A突變[10]，突變部位多位于鈉離子的關鍵區域(S4-S6)，且其中絕大多數(95%)突變為無家族遺傳傾向的新生突變，5%來自父母，但父母往往臨床表型輕微。在GEFS+中，SCN1A突變率、突變部位和突變來源與Dravet綜合征均存在很大差異，突變位點分布于整個基因，大多數在鈉離子通道的核心形成區域(S4－S6)以外的部位[11]。本研究的家系1以及國內許小箐等[12]對39個家系進行SCN1A的突變研究中2個錯義突變的家系位于鈉通道α亞單位S4～S6重要功能區，該功能區為電壓感受和門控區，可影響細胞興奮性[13]。以上3個家系中未見嚴重表型，臨床表型譜也主要以FS和FS+為主，說明在GEFS+家系中，SCN1A突變位置與其臨床表型嚴重程度并未存在必然聯系。

國外有報道顯示，在GEFS+家系常染色體顯性遺傳[14-15]之外，可能存在多基因協同作用。另有文獻報道，在GEFS+家系中部分成員存在兩種不同的基因突變[16]。本研究家系2中父母雙方均有熱性驚厥家族史，因先證者和母親都存在相同的15號外顯子雜合突變(c. 2592G＞A)，故其SCN1A基因突變來自母系，但是由于未能測定母系其他受累者是否具備相同的基因突變，所以尚不能肯定該突變為致病突變，對于是否存在雙系遺傳，需完善父系其他成員的SCN1A檢測，及對先證者和父系其他離子通道基因的篩查。家系3中存在SCN1A第9和第26兩個外顯子的同義突變，說明GEFS+家系在遺傳方式上的復雜性和多樣性，因未能采集家系中父母及其他成員血樣，所以無法明確該突變是來自單純母系或父母雙方，至于是否為致病突變則有待完善家系中其他成員的基因篩查才能確定。既往認為同義突變大都被視為無義突變，國外尚未發現對GEFS+家系同義突變進行報道，國內有文獻將先證者的同義突變視為單核苷酸多態性，未對家系其他成員做進一步的基因檢測和分析[17]。但越來越多的研究表明，同義突變會影響蛋白質的功能，如引起mRNA剪接異常[18]，影響mRNA穩定性等，從而影響蛋白質的表達和酶的活性[19]。另外，有關密碼子的偏倚影響蛋白質的三級結構假說，也于2007年得到證實[20]。本研究的局限在于，前期研究者對于同義突變意義的認識不足，加上家屬配合度不高，未能對家系2和3的血樣采集進行完善并進一步分析，希望在后續的研究中能得以完善。

GEFS+是一種離子通道病，與其相關的致病基因有5種離子通道蛋白亞單位基因(SCN1A、SCN2A、SCN1B、GABRG2、GABRD)，分別為編碼電壓門控鈉離子α1、α2、β1亞單位和編碼配體門控氯離子通道的GABAA受體γ2、δ亞單位，但突變檢出率低，SCN1A基因突變率普遍在10%左右。本研究在10個GEFS+家系研究中發現1個新的錯義突變c.4330G＞A和3個同義突變，其中一個家系存在2個外顯子同時突變情況，另外7個家系未發現SCN1A基因突變。GEFS+家系遺傳機制復雜，SCN1A基因是其中一種重要的致病基因，對于SCN1A突變家系需進一步完善家系其他成員的基因篩查。另外，對本研究10個家系進行其他離子通道相關基因或全基因組的檢測，將有助于進一步明確其遺傳發病機制。

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