竹葉柴胡與北柴胡的抗炎保肝作用比較

杜婷，杜士明，王剛，孫榮進，楊光義，葉方，袁玲玲，劉濤

(1.湖北醫藥學院附屬太和醫院藥學部，十堰 442000;2.湖北醫藥學院藥學院，十堰 442000;3.湖北醫藥學院附屬太和醫院病理科，十堰 442000)

柴胡是我國傳統中藥，臨床應用廣泛，具有解熱、鎮痛、抗炎、增強免疫、保肝利膽、抗菌、抗病毒及抗腫瘤等作用[1-2]。《中華人民共和國藥典》(2010年版)收載的柴胡品種為北柴胡(Bupleurum chinense DC.)或狹葉柴胡(B.scorzonerifolium Willd.)的干燥根，而市場對柴胡需求量很大，北柴胡藥用植物資源的供應相對缺乏。本課題組對鄂西北地區柴胡資源調查結果表明，本地區野生柴胡品種均為竹葉柴胡，尚未發現有野生和人工栽培的北柴胡[3]。前期研究表明，本產地竹葉柴胡質量均符合《中華人民共和國藥典》規定[4]，筆者在此基礎上進一步比較竹葉柴胡和北柴胡的抗炎及保肝作用，為合理地開發和綜合利用柴胡藥用植物資源及其臨床應用提供參考。

1 材料與方法

1.1 動物 斯波雷格·多雷(Sprague Dawley，SD)大鼠，SPF級，體質量(200±20)g，雌雄各半，合格證號:4200900016;昆明種小鼠，SPF級，體質量(20±2)g，雌雄各半，合格證號:4200900014，實驗動物生產許可證號:SYXK(鄂)2011-0031，均由湖北醫藥學院動物實驗中心提供。

1.2 試藥與試劑 竹葉柴胡由湖北神農本草中藥飲片有限公司種植基地提供(批號:20111220);北柴胡由山西省運城縣北柴胡種植基地提供(批號:20111020)，經湖北中醫藥大學陳科力教授鑒定分別為竹葉柴胡(Bupleurum marginatum Wall.ex DC.)、北柴胡(Bupleurum chinense DC.);柴胡水煎劑的制備:柴胡藥材分別經水煎煮、濃縮成每毫升含生藥0.5 g的竹葉柴胡水煎液和北柴胡水煎液;0.9%氯化鈉溶液，安徽環球藥業有限公司，批號:A120308F;二甲苯，武漢市江北化學試劑有限公司，批號:20051121;四氯化碳(CCl4)，天津市天力化學試劑有限公司，批號:20121009;超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、丙二醛(malondialdehyde，MDA)、谷胱甘肽(glutathione，GSH)測定試劑盒，均由南京建成生物工程公司提供(批號分別為:20121021，20110401，20120203)。

1.3 儀器 JJ200電子天平(美國兄弟公司)，MH-1000調溫型電熱套(北京科偉永興儀器有限公司)，RE-52AA旋轉蒸發器(上海亞榮生化儀器廠)，FA-200電子分析天平(上海精密儀器廠)，千分尺(上海新濱量具廠)，AO820型石蠟切片機(美國)，光學顯微鏡(日本Olympus公司)。

1.4 抗炎實驗

1.4.1 耳腫脹度實驗 取小鼠60只，雌雄各半，隨機分為6組，每組10只，分別為竹葉柴胡水煎液2.5，5.0 g·kg－1劑量組;北柴胡水煎液2.5，5.0 g·kg－1劑量組;正常對照組、模型對照組給予純化水10mL·kg－1。均灌胃給藥，每天1次，連續給藥7d。末次灌胃給藥45 min后，除正常對照組外，其余各組小鼠右耳涂二甲苯0.5mL致腫，60 min后脫頸椎處死，用8 mm打孔器分別在左右耳相同部位打下圓片，稱質量，計算腫脹度和腫脹抑制百分率。腫脹度=右耳質量－左耳質量，(給藥組)腫脹抑制率(%)=(模型對照組平均腫脹度－給藥組平均腫脹度)/模型對照組平均腫脹度 ×100%[5]。

1.4.2 足腫脹實驗 取大鼠40只，雌雄各半，隨機分為5組，每組8只，分別為竹葉柴胡水煎液 2.5，5.0 g·kg－1劑量組;北柴胡水煎液2.5，5.0 g·kg－1劑量組;模型對照組給予純化水10mL·kg－1。上述5組灌胃給藥，每天1次，連續給藥3 d。實驗前用千分尺測量大鼠左后足趾厚度并記錄。末次給藥1h后，于大鼠左后足跖皮下注射10%蛋清0.1mL致炎，致炎后0.5，1，2，4，6 h 測量致炎左后足趾厚度1 次，并計算腫脹度和腫脹抑制率。腫脹率(%)=(致炎后足趾厚度－致炎前足趾厚度)/致炎前足趾厚度×100%;腫脹抑制率(%)=(模型對照組平均腫脹率－給藥組平均腫脹率)/模型對照組平均腫脹率×100%。

1.5 對CCl4所致小鼠肝損傷模型的保護作用 取實驗用小鼠60只，雌雄各半，隨機分為6組，每組10只，分別為竹葉柴胡水煎液 2.5，5.0 g·kg－1劑量組;北柴胡水煎液 2.5，5.0 g·kg－1劑量組;正常對照組;模型對照組。各給藥組分別灌胃給藥，每天1次，連續給藥7d，正常對照組、模型對照組給予同等體積的純化水，末次給藥后禁食不禁水，1h后除正常對照組腹腔注射等量的0.9%氯化鈉溶液外，其余各組小鼠均腹腔注射0.1%CCl4花生油溶液0.01mL·g－1。造模16 h后摘眼球取血，常規分離血清及肝組織，備用[6-7]。

1.5.1 血清生化指標檢測 取備用血清按試劑盒說明操作，測定丙氨酸氨基轉移酶(alanine aminotransferase，ALT)、天冬氨酸氨基轉移酶(aspartate aminotransferase，AST)、堿 性 磷 酸 酶 (alkaline phosphatase，ALP)含量。

1.5.2 肝組織生化指標 取肝組織，用冰冷0.9%氯化鈉溶液沖去血漬，濾紙吸干水分，加TMS緩沖液制得100 g·L－1肝勻漿，4 ℃，12261 ×g離心20 min，取上清液備用，按試劑盒說明操作，測定SOD、MDA、GSH的含量。

1.5.3 病理組織學及免疫組化觀察 留取部分肝組織于4%多聚甲醛固定液固定，常規石蠟包埋、脫水，切片。蘇木精-伊紅染色，光鏡下觀察肝細胞病理形態學改變。免疫組化S-P法檢測大鼠肝組織轉化生長因子 β(transforming growth factor-β，TGF-β)、核因子-κB(nuclear factor kappB，NF-κB)蛋白的表達。

2 結果

2.1 抗炎實驗

2.1.1 耳腫脹度實驗 結果見表1。竹葉柴胡和北柴胡5.0 g·kg－1劑量組與模型對照組比較均差異有統計學意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明竹葉柴胡與北柴胡對二甲苯所致小鼠耳腫脹有抑制作用。但兩者比較差異無統計學意義(P＞0.05)，表明二者對小鼠耳腫脹的抑制作用相近。竹葉柴胡和北柴胡2.5 g·kg－1劑量組與模型對照組比較，略有改善，但均差異無統計學意義(均 P ＞0.05)，說明兩種柴胡 2.5 g·kg－1劑量對二甲苯所致小鼠耳腫脹無明顯抑制作用。

2.1.2 足趾腫脹實驗 結果見表2。竹葉柴胡和北柴胡5.0 g·kg－1劑量組在 2.0，4.0，6.0 h 時與模型對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05或 P＜0.01)，表明二者可抑制大鼠足趾腫脹，但兩者腫脹率差異無統計學意義(P ＞0.05)。在 2.0，4.0，6.0 h 時，2.5 g·kg－1北柴胡的腫脹抑制率分別為30.87%，19.42%，23.18%;竹葉柴胡的腫脹抑制率分別為7.12%，10.07%，9.59%。竹葉柴胡和北柴胡水煎液在5.0 g·kg－1呈現較強的抗炎作用，竹葉柴胡2.5 g·kg－1抗炎作用較弱。

2.2 對CCl4所致小鼠肝損傷模型的保護作用

2.2.1 血清生化指標檢測 見表3。結果顯示正常對照組與模型對照組比較差異有統計學意義，說明CCl4致小鼠急性肝損傷造模成功。治療組ALP與模型對照組比較均差異無統計學意義(均P＞0.05);竹葉柴胡5.0 g·kg－1組ALT與模型對照組比較差異無統計學意義(P ＞0.05)，北柴胡5.0 g·kg－1組 ALT 與模型對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05);竹葉柴胡、北柴胡2.5 g·kg－1組 ALT、AST 與模型對照組比較均差異有統計學意義(均P＜0.05)，且兩者ALT、AST值差異無統計學意義(P＞0.05)，表明竹葉柴胡、北柴胡在2.5 g·kg－1有保護CCl4所致小鼠急性肝損傷作用，且作用相近。

2.2.2 肝組織生化指標 見表4。結果顯示正常對照組與模型對照組比較差異有統計學意義(P＜0.05)，表明造模成功。竹葉柴胡和北柴胡5.0 g·kg－1組MDA含量與模型對照組比較明顯下降(P＜0.05)，2.5 g·kg－1組與模型對照組比較差異無統計學意義(P＞0.05);竹葉柴胡和北柴胡各劑量組SOD、GSH含量與模型對照組比較均明顯上升(均P＜0.05或P＜0.01)，竹葉柴胡與北柴胡相同劑量組間的SOD、GSH均差異無統計學意義(均P＞0.05)，表明竹葉柴胡、北柴胡5.0 g·kg－1均可提高肝組織抗氧化酶活性，抑制氧自由基引起的脂質過氧化。

表1 6組小鼠耳腫脹情況比較Tab.1 Comparison of ear swelling among six groups of mice mg，

表1 6組小鼠耳腫脹情況比較Tab.1 Comparison of ear swelling among six groups of mice mg，

與正常對照組比較，*1 P ＜0.05;與模型對照組比較，*2 P＜0.05，*3 P ＜0.01Compared with normal control group，*1 P ＜0.05;compared with model control group，*2 P ＜0.05，*3 P ＜0.01

率/%正常對照組 10 … 3.75±0.93 3.90±0.83 0.17±0.33組別 小鼠/只劑量/(g·kg－1) 左耳質量 右耳質量 腫脹度 腫脹抑制…模型對照組 10 … 4.37±0.54 6.25±0.44 1.87±0.31*1 …竹葉柴胡水煎液組 10 2.5 5.60 ±1.36 7.13 ±0.78 1.50 ±0.66 18.70 ±9.0210 5.0 6.54 ±0.63 7.54 ±0.68 1.00 ±0.22*2 46.70 ±12.30北柴胡水煎液組 10 2.5 5.06 ±0.70 6.44 ±1.46 1.50 ±0.55 20.00 ±8.9710 5.0 5.50 ±1.31 6.14 ±1.24 0.64 ±0.15*3 65.80 ±11.80

表2 5組大鼠足趾腫脹不同時間點的腫脹率比較Tab.2 Comparison of the swelling rate of toes among six groups of rats at different time points %，

表2 5組大鼠足趾腫脹不同時間點的腫脹率比較Tab.2 Comparison of the swelling rate of toes among six groups of rats at different time points %，

與模型對照組比較，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01Compared with model control group，*1 P ＜0.05，*2 P ＜0.01

組別 大鼠/只0.5 h 1.0 h 2.0 h 4.0 h 6.0 h劑量/(g·kg－1)模型對照組 8 … 56.56±3.20 58.24±9.60 54.16±9.30 52.60±7.60 47.10 ±7.20竹葉柴胡水煎液組 8 2.5 45.40 ±10.60 51.88 ±11.80 50.30 ±8.60 47.30 ±2.60 42.58 ±5.8085.0 51.38 ±8.60 55.02 ±5.70 41.26 ±6.60*1 36.98 ±7.00*1 27.52 ±2.80*2北柴胡水煎液組 8 2.5 51.80 ±15.50 53.20 ±21.70 37.44 ±15.50*1 42.38 ±17.80*1 36.18 ±10.30*1 85.0 48.74 ±6.50 55.76 ±8.90 37.16 ±8.10*1 27.56 ±5.30*2 24.26 ±2.40*2

表3 6組小鼠血清ALT、AST和ALP的含量比較Tab.3 Comparison of the serum level of ALT，AST and ALP among six groups of mice U·L－1，

表3 6組小鼠血清ALT、AST和ALP的含量比較Tab.3 Comparison of the serum level of ALT，AST and ALP among six groups of mice U·L－1，

與正常對照組比較，*1 P＜0.05;與模型對照組比較，*2 P＜0.05Compared with normal control group，*1 P ＜0.05;compared with model control group，*2 P ＜0.05

ALT AST ALP正常對照組 10 …組別 小鼠/只 劑量/(g·kg－1)163.50 ±56.32 379.50 ±104.30 202.00 ±62.53模型對照組 10 … 345.80±112.70*1 508.40±123.60*1 156.80±53.26*1竹葉柴胡水煎液組 10 2.5 213.00 ±82.14*2 313.25 ±86.19*2 172.00 ±69.5810 5.0 323.00 ±91.46 481.60 ±96.43 143.60 ±32.76北柴胡水煎液組 10 2.5 152.67 ±48.62*2 373.67 ±102.60*2 150.30 ±48.7910 5.0 191.50 ±65.13*2 474.00 ±134.61 129.30 ±53.68

表4 6組小鼠肝組織SOD、MDA、GSH的含量比較Tab.4 Comparison of hepatic content of SOD，MDA and GSH among six groups of mice

表4 6組小鼠肝組織SOD、MDA、GSH的含量比較Tab.4 Comparison of hepatic content of SOD，MDA and GSH among six groups of mice

與正常對照組比較，*1 P ＜0.05;與模型對照組比較，*2 P＜0.05，*3 P ＜0.01Compared with normal control group，*1 P ＜0.05;compared with model control group，*2 P ＜0.05，*3 P ＜0.01

組別 小鼠/只 劑量/(g·kg－1)SOD GSH(U·g－1)MDA/(nmol·mL－1)正常對照組 10 …156.43 ±7.23 112.59 ±19.35 3.67 ±0.43模型對照組 10 … 67.25±12.04*1 78.33±15.56*1 6.34±1.01*1竹葉柴胡水煎液組 10 2.5 92.34 ±8.45*2 99.29 ±25.53*2 5.02 ±0.5310 5.0 105.65 ±14.90*3 106.65 ±13.56*3 4.28 ±0.34*2北柴胡水煎液組 10 2.5 97.12 ±6.47*2 104.35 ±18.23*3 5.18 ±0.3610 5.0 113.00 ±12.64*3 121.45 ±25.12*3 4.01 ±0.42*2

2.2.3 病理組織學結果 見圖1。正常對照組肝組織無異常病變，肝小葉結構清晰完整，肝細胞索排列整齊，無肝細胞脂肪變性、壞死，無炎細胞浸潤。模型對照組肝組織損傷嚴重，細胞排列紊亂，部分肝竇消失，肝小葉結構破壞，中央靜脈周圍可見少量壞死肝細胞，有炎細胞浸潤，肝細胞明顯腫脹、變性、細胞質疏松，多為脂肪樣變性，可見碎片狀壞死。竹葉柴胡水煎液組和北柴胡水煎液組脂肪變性較少，炎細胞浸潤較模型對照組減輕;5.0 g·kg－1組較2.5 g·kg－1組炎細胞浸潤較輕，肝細胞脂肪變性較少。結果表明竹葉柴胡和北柴胡水煎液對CCl4致小鼠急性肝損傷均有治療作用。

2.2.4 免疫組化結果 見圖2。正常對照組肝組織只有少量TGF-β陽性表達，著色較淺，范圍較窄(圖2A);而模型對照組TGF-β陽性表達較強，陽性染色多見于匯管區病變肝細胞胞質內，細胞質呈棕黃色散在分布，陽性表達密度高于正常對照組(圖2B);竹葉柴胡和北柴胡水煎液組與模型對照組比較，TGF-β陽性表達均有不同程度的減輕，表明了竹葉柴胡和北柴胡均能抑制肝損傷小鼠肝組織TGF-β陽性表達;而竹葉柴胡和北柴胡水煎液5.0 g·kg－1組 TGF-β陽性表達分別低于兩者的水煎液2.5 g·kg－1組，竹葉柴胡與北柴胡水煎液組TGF-β陽性表達無顯著性差異。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.竹葉柴胡水煎液 2.5 g·kg－1組;D:竹葉柴胡水煎液 5.0 g·kg－1組;E.北柴胡水煎液2.5 g·kg－1組;F.北柴胡水煎液 5.0 g·kg－1組圖1 6組小鼠肝臟病理組織學檢查結果(×200)A.normal control group;B.model control group;C.2.5 g·kg－1 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.group;D.5.0 g·kg－1 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.group;E.2.5 g·kg－1 Bupleurum chinense DC.group;F.5.0 g·kg－1 Bupleurum chinense DC.groupFig.1 Hepatic histopathology of six groups of mice(×200)

正常對照組肝組織NF-κB陽性表達較少，見于細胞質內、著色較淺(圖3A);而模型對照組肝組織NF-κB陽性表達較強，陽性反應的部位多見于匯管區病變肝細胞胞質內，血管周圍部分脂肪變性的肝細胞，呈棕黃色顆粒(圖3B);竹葉柴胡和北柴胡給藥組NF-κB陽性表達明顯低于模型對照組(圖3)，但高于空白組，表明竹葉柴胡和北柴胡均有保肝作用;北柴胡劑量組NF-κB陽性表達低于竹葉柴胡劑量組，差異無統計學意義。

3 討論

血清生化指標和肝組織生化指標實驗結果顯示，竹葉柴胡和北柴胡2.5 g·kg－1組對CCl4實驗性肝損傷小鼠有促進肝內脂質代謝的作用，使ALT、AST含量降低，SOD、GSH含量升高，表明竹葉柴胡和北柴胡通過減少氧自由基拮抗肝臟損傷，這與其他學者的結論一致[8]。竹葉柴胡和北柴胡均不同程度地下調TGF-β的表達，提示柴胡能通過抑制TGF-β合成，阻斷其信號途徑，減輕肝星狀細胞活化程度，緩解肝纖維化。同時，TGF-β 的合成受核轉錄因子 NF-κB 等的調控[9]。本研究結果顯示竹葉柴胡和北柴胡可抑制NF-κB的表達。NF-κB與DNA接觸，可啟動許多基因的轉錄，調控的基因可以編碼急性反應蛋白、細胞黏附分子等，其中包括腫瘤壞死因子α和β、粒-巨噬細胞集落刺激因子、白細胞介素6等，通過調控它們的轉錄過程，直接參與肝臟炎癥、肝細胞再生和凋亡等病理生理過程[10]。本實驗在考察竹葉柴胡與北柴胡的抗炎保肝作用的基礎上，探討了兩者保肝作用機制，為進一步闡明柴胡藥理作用提供參考。

在本研究中血清生化指標AST、ALT、ALP的變化與柴胡水煎液的劑量不成正比，在2.5 g·kg－1時能顯著降低 AST、ALT 的指標，但是 5.0 g·kg－1時效果不顯著，可能與柴胡劑量過大產生了急性肝毒性有關，導致 AST、ALT 值偏高[11]。

A.正常對照組;B.模型對照組;C.竹葉柴胡水煎液 2.5 g·kg－1組;D.竹葉柴胡水煎液 5.0 g·kg－1組;E.北柴胡水煎液2.5 g·kg－1組;F.北柴胡水煎液 5.0 g·kg－1組圖2 6組小鼠TGF-β表達結果(×400)A.normal control group;B.model control group;C.2.5 g·kg－1 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.group;D.5.0 g·kg－1 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.group;E.2.5 g·kg－1 Bupleurum chinense DC.group;F.5.0 g·kg－1 Bupleurum chinense DC.groupFig.2 TGF-β expression of six groups of mice(×400)

A.正常對照組;B.模型對照組;C.竹葉柴胡水煎液 2.5 g·kg－1組;D.竹葉柴胡水煎液 5.0 g·kg－1組;E.北柴胡水煎液2.5 g·kg－1組;F.北柴胡水煎液 5.0 g·kg－1組圖36組小鼠NF-κB表達結果(×200)A.normal control group;B.model control group;C.2.5 g·kg－1 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.group;D.5.0 g·kg－1 Bupleurum marginatum Wall.ex DC.group;E.2.5 g·kg－1 Bupleurum chinense DC.group;F.5.0 g·kg－1 Bupleurum chinense DC.groupFig.3 NF-κB expression of six groups of mice(×200)

本實驗結果顯示竹葉柴胡與北柴胡的水煎液在抗炎、保肝藥理作用方面差異無統計學意義，結合前期質量評價分析結果[4]顯示，竹葉柴胡與北柴胡在主要活性成分含量及藥理作用方面均差異無統計學意義。

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