艾灸肺俞和心俞對慢性心力衰竭大鼠心室質量指數及心肌組織TNF－α、IL－6mRNA表達水平的影響

王 莖，曾永蕾，武鳳琴，孫瑞瑞，陳 靜

（1.安徽中醫藥大學中醫臨床學院，安徽 合肥 230038；2.安徽中醫藥大學第二附屬醫院，安徽 合肥 230061；3.安徽中醫藥大學研究生部，安徽 合肥 230038）

慢性心力衰竭（chronic heart failure，CHF）病變機制較為復雜。近年來研究表明，心室重塑是其發生發展的關鍵［1］，而免疫和炎性遞質在心力衰竭的發生及進展過程中起著重要的作用［2］。腫瘤壞死因子－α（tumor necrosis factorα，TNF－α）、白細胞介素－6（interleukin－6，IL－6）作為炎性細胞因子，可長期影響心肌組織的重塑，參與CHF的病理生理過程［3］。艾灸對免疫系統［4］和心血管系統［5］具有良好的調整作用，且艾灸具有容易操作、不良反應少、作用顯著等優勢。本實驗以心室質量指數及TNF－α、IL－6mRNA表達水平作為觀測指標，擬從免疫炎癥角度，初步探討艾灸肺俞、心俞對CHF心室重塑的影響機制。

1 材料

1.1 動物 健康SD大鼠35只，雄性，SPF級，體質量180～220g，由安徽中醫藥大學實驗動物中心提供。

1.2 主要儀器 ABI－2720型PCR儀：美國應用生物系統公司；Tanon 3500型電子凝膠成像系統：上海天能公司。

1.3 試劑和藥物 RNA抽提試劑盒、逆轉錄試劑盒及 TNF－α、IL－6、β－actin特異性引物均為江蘇省南京諾維贊公司產品，其序列及擴增長度見表1。阿霉素（adriamycin，ADR）：浙江海正藥業股份有限公司生產，批號 H33021980，每支10mg。卡托普利：上海旭東海普藥業有限公司，生產批號H31020564，每片25mg。

表1 TNF－α、IL－6、β－actin擴增引物序列及產物長度

2 方法

2.1 模型復制 采用ADR隔日腹腔注射的方法［6］復制CHF模型，ADR長期小劑量累積給藥，可誘導嚴重的CHF模型，且可靠簡便［7］。SD大鼠適應性喂養1周后進行模型復制，劑量依次為1、2、3、4mg／kg，每個劑量給藥2次，依次遞增，隔日1次，共8次，累積量20mg／kg，持續15d。正常喂養3周，每日密切觀察大鼠精神狀態、活動、進食飲水量、體質量及呼吸頻率變化。以左心室濕質量／體質量比值和右心室濕質量／體質量比值分別代表左心室質量指數（left ventricular mass index，LVMI）和右心室質量指數（right ventricular mass index，RVMI），以反映心室重構情況［8］，結合大鼠一般情況及心率，作為模型復制成功的標準［9］。

2.2 動物分組 將35只大鼠隨機抽取28只用于模型復制，另7只作正常組。正常喂養3周，將28只模型大鼠分為4組，即模型組、西藥組、艾灸組、艾灸加西藥組。

2.3 治療方案 模型復制3周后開始進行。

2.3.1 西藥組：給予卡托普利混懸液（25mg／kg）灌服，每日1次，連續3周。

2.3.2 艾灸組：取雙側肺俞、心俞，定位參照《實驗針灸學》大鼠標準穴位圖譜［10］，行艾條溫和灸，用特制小艾條在距離穴位1～2cm處施灸，每次每穴各灸15min，每日1次，共3周。

2.3.3 艾灸加西藥組：先給予卡托普利（25mg／kg）混懸液灌服，再用艾條溫和灸肺俞、心俞，每日1次，連續3周。

2.3.4 模型組和正常組：正常喂養，不進行任何治療。期間注意觀察各組大鼠行為特征。

2.4 指標觀察

2.4.1 心室肌組織取材與保存：將大鼠稱質量，用4%戊巴比妥鈉溶液（40mg／kg）腹腔注射麻醉后，將其仰臥固定于鼠臺，腹主動脈放血處死，開胸暴露心臟，結扎出入心臟大血管，于右心室剪一小口，用4℃預冷的生理鹽水逆行灌注，沖洗心室腔至沖洗液無血性液體。取出心臟，用清潔濾紙吸干水分后，分別稱取左、右心室（包括室間隔）濕質量，全過程于冰浴中進行。計算左、右心室濕質量／體質量比值，為心室質量指數。處理后心肌凍存于液氮中，液氮冷凍后轉存于－70℃超低溫冰箱，用于RT－PCR檢測。

2.4.2 RT－PCR 法檢測心肌組織TNF－α、IL－6 mRNA水平：①總RNA提取：按所購總RNA抽提試劑盒說明進行。②逆轉錄：取2μl RNA溶液做模板，總反應體積為55μl，具體步驟按逆轉錄試劑盒說明書進行。③PCR擴增 TNF－α及IL－6：PCR反應總體積50μl，預變性95℃，3min，變性98℃，10s，退火58℃15s；延伸72℃，30s；30個循環，末次循環后再72℃延伸1min。β－actin反應條件，同目的擴增產物的反應條件。1%瓊脂糖凝膠電泳，在電子凝膠成像儀上檢測PCR產物。結果以TNF－α及IL－6與同組β－actin電泳帶光密度的比值，作為該組標本的基因表達的相對值。

2.5 統計學方法 運用SPSS17.0統計軟件進行統計分析。分析前對數據進行正態性檢驗，連續型變量采用“均數±標準差（±s）”進行統計學描述。多組均數比較采用單因素方差分析，兩組之間均數比較采用LSD分析（方差齊時）或Tamhane'sT2分析（方差不齊時）。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 大鼠一般情況 從第8天開始，與正常組比較，模型組大鼠陸續出現精神萎靡、活動減少、倦臥、反應遲鈍、呼吸困難，體質量下降等現象。從治療第2周開始，治療組大鼠氣喘、食欲下降、萎靡倦怠等有不同程度改善，大鼠反應性提高；模型組上述癥狀依然存在，總體上有加重趨勢；正常組大鼠活動、反應靈敏性如常，體質量上升。

3.2 各組大鼠心室肌質量指數比較 與正常組比較，模型組大鼠LVMI和RVMI顯著增高（P＜0.01）；與模型組比較，西藥組、艾灸組、艾灸＋西藥組LVMI和RVMI顯著降低（P＜0.05，或P＜0.01）。結果表明艾灸能顯著降低心室肌質量指數。見表2。

表2 各組大鼠心室肌質量指數比較（±s）

表2 各組大鼠心室肌質量指數比較（±s）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，△P＜0.05，△△P＜0.01。

正 常7 2.136±0.252 0.534±0.063模 型 7 2.823±0.314＊＊ 0.724±0.080＊＊西 藥 7 2.450±0.291△ 0.615±0.073△艾 灸 7 2.490±0.355△ 0.627±0.090△艾灸＋西藥 7 2.194±0.280△△ 0.550±0.070△△

3.3 各組大鼠心肌組織 TNF－α、IL－6mRNA 相對表達水平比較 與正常組比較，模型組大鼠TNF－α、IL－6mRNA相對表達水平顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，3個治療組 TNF－α、IL－6mRNA 相對表達水平顯著降低，（P＜0.01）。見表3、圖1。

表3 各組大鼠心肌組織 TNF－α、IL－6mRNA相對表達水平比較（±s）

表3 各組大鼠心肌組織 TNF－α、IL－6mRNA相對表達水平比較（±s）

注：與正常組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，△△P＜0.01。

正 常7 1.005±0.128 1.018±0.376模 型 7 5.024±0.640＊＊ 5.189±0.749＊＊西 藥 7 2.439±0.346△△ 2.546±0.344△△艾 灸 7 2.520±0.471△△ 2.988±0.471△△艾灸＋西藥 7 2.334±0.327△△ 2.414±0.460△△

圖1 RT－PCR檢測各組大鼠心肌組織TNF－α、IL－6mRNA相對表達水平

4 討論

關于CHF發病和心室重塑形成機制的研究，正不斷深入。近年研究發現，CHF不僅存在血流動力學紊亂，更重要的是激活了包括交感神經系統和腎素－血管緊張素－醛固酮系統在內的一系列神經內分泌反應［11－12］。炎性細胞因子在CHF心室重塑的演變過程中，扮演著非常重要的角色。高水平表達的炎性細胞因子TNF－α、IL－6，作用于細胞膜上的特殊受體，導致細胞凋亡，引起心臟間質纖維化、心肌收縮力下降和心室重構等。血漿中TNF－α、IL－6水平增高的患者，存在病死率增高的趨勢。TNF－α、IL－6可長期影響心肌重塑，參與CHF的病理生理過程。它們通過促使左心室擴大、降低左心室收縮能力和誘導凋亡使心臟功能減退［3］。

本實驗采用ADR隔日腹腔注射的模型復制方法。有研究［7］證實，ADR作為一種高效蒽醌類廣譜抗腫瘤藥物，其心臟毒性作用機制表現為抑制谷胱甘肽過氧化物酶活性，破壞細胞膜的結構和功能，影響線粒體的能量代謝，隨其劑量在動物體內積累增加而導致心肌細胞變性壞死，從而引起嚴重的心力衰竭，多用于復制慢性心力衰竭模型。而腹主動脈半縮窄術構建的是舒張性心力衰竭模型［6］，手術操作難度大，縮窄程度與結扎很難一致，病死率較高。預實驗表明，ADR隔日腹腔注射的方法復制模型的效果較好，病死率低。

心俞是心的背俞穴，具有調理氣血、養心安神、寧心定志之功，為歷代醫家治療心胸病癥之要穴。現代研究［13］表明，針刺不僅能有效地緩解患者的癥狀，而且能影響血流動力學參數。肺俞是肺的背俞穴，具宣肺通氣、疏調上焦之功。現代研究［14］證明，針刺肺俞穴能明顯改善肺功能，增大肺通氣量，主要治療呼吸系統疾病。肺與心表現為氣血關系，故肺俞可用于治療與氣血關系最為相關的心血管疾病。

艾灸肺俞、心俞能顯著改善心功能和降低血漿內皮素水平［15］，說明艾灸對神經內分泌系統和心血管系統有良性調整作用。本課題在此基礎上，進一步觀察心室質量指數，并檢測心室肌 TNF－α、IL－6 mRNA表達水平，探討艾灸對慢性心力衰竭心室重塑的影響。實驗結果顯示，3個治療組心室質量指數及 TNF－α、IL－6mRNA 表達水平顯著降低。有研究［16］表明，艾灸刺激穴位后，可引起機體神經－內分泌系統功能的變化，釋放某些生物活性物質，激活靶細胞信號轉導。本研究提示，艾灸肺俞、心俞穴對緩解CHF心室重塑、改善心肌肥厚有著積極意義，為臨床治療CHF拓寬了思路。有關艾灸對CHF心室重塑的影響及其相關的神經－內分泌－免疫機制，還有待進一步深入探討。

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