黃蒲通竅膠囊對血管性癡呆大鼠行為學表現及海馬CA1區病理變化的影響

王 艷，謝道俊，鮑遠程，張 娟，儲丹晨，韋 彪，孫愘叡，丁偉軍，鮑婷婷，王秋燁，趙志勇

（1.安徽省亳州市華佗中醫院腦病科，安徽 亳州 236800；2.安徽中醫藥大學第一附屬醫院腦病科，安徽 合肥 230031；3.安徽省六安市中醫院腦病科，安徽 六安 237006）

血管性癡呆（vascular dementia，VaD）是指由缺血性卒中、出血性卒中等腦血管疾病導致的嚴重認知功能障礙綜合征［1］。隨著腦血管疾病發病率的提高，VaD的發病率也在迅速增加，近來有研究人員采用整體抽樣方法調查了上海市、黑龍江省、山西省和廣東省的城鄉社區60歲以上老年人，老年癡呆癥的患病率為5.2%［2］。VaD的主要表現有兩大方面：認知功能障礙和相關腦血管病區的神經功能障礙。VaD的臨床分類包括多梗死性癡呆、關鍵部位梗死性癡呆、皮質下血管性癡呆和小血管性癡呆［3］。VaD不同于阿爾滋海默病，它是目前唯一可以防治的癡呆。本研究采用雙側頸總動脈永久性結扎法復制VaD大鼠模型，并采用黃蒲通竅膠囊進行治療，以觀察其對VaD大鼠行為學表現和海馬CA1區病理變化的影響。

1 材料

1.1 實驗動物 雄性健康Wistar大鼠90只，8周齡，清潔級，體質量200～230g，由上海斯萊克實驗動物有限責任公司提供，生產許可證號為SCXK（滬）2012－0002，適應性喂養2周。

1.2 藥物 多奈哌齊：衛材（中國）藥業有限公司生產，批號為國藥準字H20050978；黃蒲通竅膠囊（由人參、大黃、石菖蒲、益智仁、川芎、郁金等組成）：安徽中醫藥大學第一附屬醫院藥劑科制備，批準文號為皖藥制字Z20080006，生產批號為20120618。

1.3 儀器 Morris水迷宮及相關動物行為學實驗視頻分析系統：安徽省淮北正華生物儀器設備有限公司。

2 方法

2.1 模型復制 采用永久性結扎雙側頸總動脈法［4］復制VaD大鼠模型。大鼠術前12h禁食，自由飲水。用3.5%水合氯醛腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠仰臥，固定于自制的大鼠手術操作木板上，頸部皮膚剪毛備皮，碘伏常規無菌操作，酒精棉球脫碘。切口位于頸正中線處，長約1cm，鈍性分離皮下組織后，于切口正下方的斜方肌與氣管夾角處可見左側頸總動脈搏動，分離出左側頸總動脈后，以4號絲線遠近端雙重結扎，從中剪斷。右側操作方法與左側相同。術中動作輕柔，避免鉗夾和過分牽拉迷走神經，注意無菌原則，行逐層間斷縫合術，術后放入保溫的鼠籠（電熱毯保溫），待大鼠清醒后，放回動物籠架上單籠飼養，予自由進食進水，術后連續5d每天以碘酒擦洗傷口及周圍皮膚。假手術對照組大鼠的雙側頸總動脈不結扎，其余與模型組操作方法一致。

2.2 實驗分組與處理 將大鼠適應性喂養2周后，隨機分為5組，即模型組、多奈哌齊組及黃蒲通竅組，各22只，假手術組及正常對照組各12只。術后24h各組予相應藥物灌胃：正常組、假手術組及模型組：給予生理鹽水灌胃（每日5.0ml／kg）；多奈哌齊組：每日給予多奈哌齊溶液0.63mg／kg；黃蒲通竅組：每日給予黃蒲通竅溶液1.51g／kg，連續灌胃45d后，進行Morris水迷宮試驗，觀察腦組織病理變化。

2.3 行為學檢測 Morris水迷宮主要用于測試動物對空間位置覺和方向覺（空間定位）的學習記憶能力，是檢測動物記憶能力的重要工具［5］。Morris水迷宮可同步記錄大鼠逃避潛伏期、跨越平臺次數、目標象限次數、目標象限距離等相關數據。本研究從術后第40天開始Morris水迷宮試驗，設置最大潛伏時間為180s，實驗分為兩部分［6］。①定位航行實驗：用于訓練和測量大鼠對水迷宮學習和記憶的能力。實驗歷時5d。第1天，水中不放平臺，上午將大鼠放入水中適應游泳環境3min，最后將大鼠引至平臺上；下午記錄動物游泳3min的軌跡，作為對照數據（圖1第1天下午數據）。從第2天開始，選一個象限放置平臺，每天分上午、下午分別從4個象限各選一個入水點，將大鼠面向池壁分別從4個入水點放入水中，計算機自動記錄大鼠從入水開始至尋找到平臺所需的時間，即為逃避潛伏期。從一個入水點放入水中至大鼠找到平臺為一個訓練程序；如果大鼠3min內未找到平臺，將其引至平臺，并停留40s，逃避潛伏期記為3min，每次訓練間隔為1min，上午、下午各訓練4個程序。②空間搜索實驗：第6天，拆除平臺，然后選擇平臺所在的對角象限將大鼠面向池壁放入水中，系統自動記錄：3min內大鼠從對角象限跨躍原平臺的次數（簡稱“跨越平臺次數”）及跨越平臺所在象限的次數（簡稱“目標象限次數”），3min內游泳距離及其占游泳總距離的百分比（簡稱“目標象限距離”）。

2.4 病理學檢測 水迷宮實驗后，將大鼠斷頭處死，在冰塊上取大鼠海馬，用4%多聚甲醛灌注固定后，取海馬CA1區包埋，連續冠狀切片，片厚5μm，用蘇木精－伊紅（hematoxylin－eosin，HE）染色，觀察海馬CA1的病理變化。

2.5 統計學方法 采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。連續型變量采用“均數±標準差（±s）”進行統計學描述。同組大鼠逃避潛伏期比較，采用重復測量資料的方差分析；各組跨越平臺次數、目標象限次數、目標象限距離比較，采用單因素方差分析。P＜0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 一般情況 雙側頸總動脈同時結扎術后，大鼠總體表現出活動減少，稍有煩躁，攝食及飲水不積極，其中單瞼下垂50只，雙瞼下垂20只，單瞼出血21只，雙瞼出血15只，這些情況多在48h內恢復正常，其中2只大鼠出現永久性偏癱，4只手術后出現癲癇發作（極度煩躁、抽搐等）并于24h內死亡，3只出現聲音嘶啞，1只出現飲水嗆咳。在隨后實驗過程中，2只大鼠出現傷口膿包，予以切開排膿處理，灌胃過程中死亡2只，不明原因死亡3只。結果共死亡37只（手術過程中死亡4只、術后24h死亡16只，術后24h至1周死亡10只，1周至行為學檢測期間死亡7只），礦場實驗排除焦慮、抑郁癥大鼠2只，排除永久性偏癱大鼠2只，結果共剩余49只大鼠完成本實驗（正常對照組、假手術組、模型組各9只，黃蒲通竅組12只，多奈哌齊組10只）。

3.2 Morris水迷宮結果比較

3.2.1 定位航行試驗結果比較：從第2天開始，與正常對照組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著延長（P＜0.01）；各組逃避潛伏期隨著訓練程序的增加而降低，至第4天和第5天趨于平穩，此時黃蒲通竅組和多奈哌齊組大鼠逃避潛伏期均較模型組顯著縮短（P＜0.01），但仍顯著高于對照組及假手術組（P＜0.05）；多奈哌齊組和黃蒲通竅組大鼠逃避潛伏期比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結果見圖1。

3.2.2 各組空間探索試驗結果比較：假手術組與正常對照組大鼠跨越平臺次數、目標象限次數及目標象限距離比較，差異無統計學意義（P＜0.01）；模型組上述3個指標均較假手術組顯著降低（P＜0.01）；黃蒲通竅組和多奈哌齊組上述3個指標均較模型組顯著升高（P＜0.01）；黃蒲通竅組與多奈哌齊組上述3個指標比較，差異均無統計學意義（P＞0.05）。結果見表1。

3.3 各組大鼠海馬CA1區病理變化比較 正常組和假手術組大鼠海馬CA1區錐體細胞多而排列緊密、均勻、整齊，層次清晰，胞體完整，胞漿豐富，胞核大而圓，核膜完整，核仁清晰，染色均勻。模型組大鼠海馬CA1區神經細胞數量減少，大部分神經細胞皺縮，排列紊亂，胞體形態各異，胞核著色較深，呈嗜酸性變，核固縮，核仁消失，胞漿周圍出現空暈，少數神經細胞明顯腫脹，神經細胞、神經膠質細胞與周圍的間隙明顯增寬。黃蒲通竅組大鼠海馬CA1區正常神經細胞數量較多，排列較密，層次較清晰，神經細胞結構較完整，胞核呈圓形或橢圓形，核仁清晰，染色質豐富，少數神經細胞變性、萎縮、染色較深，神經細胞周圍的間隙較模型組稍有增寬。多奈哌齊組大鼠海馬CA1區組織形態學變化與黃蒲通竅組類似。見圖2。

圖1 各組大鼠不同時間逃避潛伏期比較

表1 各組大鼠空間探索實驗結果比較（±s）

表1 各組大鼠空間探索實驗結果比較（±s）

注：與假手術組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01。

正常對照9 9.01±1.23 12.90±2.57 83.42±9.85假手術 9 8.59±1.67 11.64±2.70 83.41±8.20模 型 9 3.82±2.22＊＊ 5.57±1.13＊＊24.31±4.09＊＊多奈哌齊 10 6.98±1.13＃＃12.42±3.69＃＃77.23±8.23＃＃黃蒲通竅 12 6.30±0.78＃＃11.20±2.86＃＃76.75±7.36＃＃

圖2 各組大鼠海馬CA1區組織形態學變化比較（HE染色，10×40倍）

4 討論

目前，VaD模型的復制方法很多，雙側頸總動脈結扎法操作簡單，應用廣泛，很好地模擬了VaD慢性低灌注這一病理過程。雙側頸總動脈結扎法可導致海馬CA1區缺血。實驗結果表明，VaD模型海馬CA1區神經細胞凋亡、壞死嚴重，而黃蒲通竅組和多奈哌劑組大鼠海馬CA1區神經細胞凋亡、壞死明顯減輕。結果提示，VaD大鼠模型可很好地模擬慢性腦缺血致認知障礙的病理改變，是觀察慢性低灌注導致腦白質損害的有效工具；黃蒲通竅膠囊和多奈哌齊可以拮抗VaD大鼠認知功能相關腦區的病理變化。本研究中，動物模型的復制成功率較低（約為54.44%），大鼠死亡原因主要有4個方面。①雙側頸總動脈結扎后，出現急性腦缺血水腫，誘發癲癇。②手術切口雖然小，但術中因要剝離頸總動脈，牽拉損傷迷走神經導致生命節律變化。③因給藥時間達45d，每天灌胃，可能損傷大鼠食管胃黏膜。④因術前24h禁食，加之手術應激，有的大鼠可能術中出現低血糖、肺部感染、昏迷等。

Morris水迷宮廣泛應用于研究空間學習記憶機制，是最常用的動物神經行為學檢測項目。經Morris水迷宮訓練后形成的記憶是一種空間參考記憶，其儲存與提取涉及邊緣系統、基底前腦、紋狀體、小腦和其他相關區域，其記憶過程屬于陳述性記憶，而臨床上癡呆患者大多是陳述性記憶首先受損。所以，從檢測的記憶屬性來看，Morris水迷宮試驗可以用于篩選VaD的有效防治藥物［7－9］。VaD臨床病機特點以正虛為主，兼有虛實夾雜，單純實證較少見，證型有腎虛髓虧、肝腎陰虛、痰蒙清竅、瘀阻清竅、心肝火旺、心脾兩虛、氣虛血瘀等。黃蒲通竅膠囊是本課題組基于多年臨床實踐總結出來的治療VaD的院內制劑，具有益氣補腎、豁痰開竅、活血通絡的功效。前期研究［10－11］表明，黃蒲通竅膠囊能夠上調腦缺血后腦組織c－fos表達水平，下調腦組織核因子－κB表達水平，保護腦組織，抑制神經細胞凋亡，通過Fas信號通路抑制神經細胞凋亡而起到改善記憶和認知功能的作用。臨床研究［13－14］發現，黃蒲通竅膠囊可明顯改善VaD患者智能積分，提高VaD患者的血清生長抑素、精氨酸加壓素水平，降低血清一氧化氮、一氧化氮合酶的含量。本研究發現，術后45d，黃蒲通竅膠囊可以顯著拮抗VaD模型大鼠空間學習記憶能力的下降。

綜上所述，雙側頸總動脈永久性結扎可引起模型大鼠學習記憶能力下降和海馬CA1區神經細胞損傷，黃蒲通竅膠囊能夠改善模型大鼠學習記憶能力，并且能明顯改善大鼠海馬CA1區的病理變化。

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