免疫相關性血細胞減少患者血清細胞因子變化與骨髓免疫的相關性

崔東艷，吳強強，郝紅峰，岳 青，杜延會

免疫相關性血細胞減少(immune related hematocytopenia，IRH/IRP)是由于骨髓造血細胞受損導致自身免疫活化引起的一組綜合征。國內學者研究表明T淋巴細胞調控失衡，使得Th細胞平衡發(fā)生偏移并導致淋巴細胞數(shù)量、亞群與功能異常，激活體液免疫進而產生抗造血細胞自身抗體并破壞機體正常造血細胞最后導致外周血細胞減少［1］。為進一步明確IRH/IRP發(fā)生的免疫機制，探討細胞免疫和體液免疫在該病發(fā)生中的作用和意義，筆者研究并分析了89例患者外周血清各類細胞因子的變化情況并分析其與患者骨髓免疫狀況的相關性。

1 資料與方法

1．1 對象 病例組選取在筆者所在醫(yī)院就診IRH/IRP患者89例，其中男36名，女53名;年齡23～81歲。患者入院時血液分析顯示:WBC(0．6～1．8)×109/L，Hb 52～130 g/L，PLT(59～140)×109/L。患者外周血 Coombs試驗、冷凝集素試驗、酸化血清Hams溶血試驗均為陰性，細胞核型分析及其他血細胞檢測指標均正常，就診前未接受免疫調節(jié)劑及其它藥物治療。

對照組選取中心血站健康獻血員血清標本52人份作為正常對照，男24例，女28例;血液分析結果均正常，其余指標及配比變量與病例組無顯著性差異，各檢測指標的檢測與報告方法同病例組，因而具有可比性。

1．2 方 法

1．2．1 標本采集 真空采血管無菌采集患者空腹靜脈血5ml，常溫分離血清標本置于－80℃低溫冰箱儲存。

1．2．2 儀器與試劑 細胞因子ELISA檢測試劑盒為美國R＆D公司產品，酶標儀為Bio－Rad公司設備。

1．2．3 血清細胞因子濃度的檢測分析 每份血清標本每種細胞因子分別設立3孔獨立進行檢測，操作過程按照試劑盒說明書進行，分別檢測患者血清IL－2、IL－4、IL－6及IFN－γ含量，顯色后酶標儀于450 nm測定樣本OD值，結果每份標本取3孔均值，標準曲線計算各組血清細胞因子含量，IL－2、IL－4、IL－6和IFN － γ 的檢測下限分別為 15 pg/ml、16 pg/ml、15 pg/ml和 15 pg/ml。

1．2．4 觀察骨髓免疫狀況 留取患者骨穿骨髓涂片，常規(guī)瑞氏染色、細胞化學染色，觀察分析治療前后患者骨髓造血和免疫細胞的數(shù)量、分布及活化狀態(tài)。

1．3 統(tǒng)計與分析 Pearson相關性雙側檢驗分析兩組間細胞因子含量相關性;t檢驗分析血清細胞因子含量的組間差異;χ2檢驗分析兩組Th1細胞與Th2細胞活化相關細胞因子的升高率。Curve Expert對試驗結果進行標準曲線擬合分析及SPSS13．0數(shù)據(jù)分析軟件進行統(tǒng)計分析。資料經方差齊性分析，數(shù)據(jù)以珋x±s表示，檢驗水準按照α=0．05確定，以P＜0．05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2．1 血清細胞因子含量的變化 89例患者的血清細胞因子IFN－γ含量(38．75±3．67)pg/m l顯著高于對照組的(8．69 ±1．68)pg/ml(P=0．001)。病例組 IL －4含量和IL－6含量與對照組相比也明顯升高(P值分別為0．008和0．01)。但兩組間細胞因子IL－2含量無統(tǒng)計學差異(表1)。

表1 病例組與對照組血清細胞因子含量(±s，pg/m l)

表1 病例組與對照組血清細胞因子含量(±s，pg/m l)

組別 IL－2 IL－4 IL－6 IFN－γ病例組(n=89)118．44 ±9．06 144．80 ±13．25 137．64 ±11．34 38．75 ±3．67對照組(n=52)92．21 ±6．72 68．22 ±9．18 82．91 ±9．71 8．69 ±1．68 P值0．072 0．003 0．013 0．001

2．2 各組細胞因子的相關性分析 Pearson相關性分析顯示對照組血清IL－2與IL－4存在負相關，相關系數(shù)r為 －0．525(P=0．015);IL－6與 IFN －γ 負相關(r= －0．723，P ＜0．05)。其他細胞因子水平之間無顯著相關性。病例組細胞因子IL－2與IL－4、IL－6存在相關性(r=0．304和 －0．318，P 值分別為 0．013和0．009);IL－4與 IFN － γ 存在正相關(r=0．417，P=0．001)。病例組IL－6與其他細胞因子的關聯(lián)差異無統(tǒng)計學意義。

2．3 Th細胞亞群相關細胞因子升高率的分析 89例患者Th1相關細胞因子IL－2和IFN－γ含量升高率分別為49．87%和100%，Th2相關細胞因子IL－4和IL－6含量的升高率則分別為74．52%、84．61%。其中IFN － γ 變化率明顯高于 IL －6(χ2=9．900，P=0．002)有統(tǒng)計學差異，但IL－4與IFN－γ相比無統(tǒng)計學差異(P ＞0．05，表2)。

表2 IRH/IRP組Th細胞亞群活化相關細胞因子升高率統(tǒng)計學分析

2．4 骨髓免疫狀況變化情況 患者骨髓涂片組織化學染色可觀察到造血細胞破壞現(xiàn)象和有吞噬細胞活躍的吞噬現(xiàn)象，部分樣本可見異常活化的單核巨噬細胞以及形態(tài)異常的免疫細胞。

3 討論

一般認為免疫相關性血細胞減少及免疫相關性全血細胞減少(IRH/IRP)是由于各種因素導致骨髓造血細胞表面抗原發(fā)生異常改變，從而誘導免疫活化進而產生抗骨髓未成熟造血細胞自身抗體或者機體免疫細胞直接攻擊異常造血細胞，從而使得骨髓造血細胞遭到過度破壞，導致外周血細胞一系到兩系或者全血細胞減少［1］。有學者研究發(fā)現(xiàn)患者B淋巴細胞增多，Th1和Th2細胞異常及IL－4、IL－6水平升高異常，認為Th1/Th2平衡向Th2偏移，T細胞調控異常，并發(fā)現(xiàn)骨髓單個核細胞Coombs試驗陽性，且多伴有CD34+造血干/祖細胞自身抗體，介導巨噬細胞吞噬破壞血細胞。這些研究成果為IRH/IRP的抗體依賴細胞介導的細胞毒性作用(ADCC)的II型超敏反應的機制提供了理論依據(jù)，對IRH/IRP的臨床診治提供重要證據(jù)［1－4］。

本文結果顯示IRH/IRP患者外周血清IL－4、IL－6和IFN－γ不同于對照組，提示該類疾病存在免疫細胞功能的異質性改變。根據(jù)Th細胞因子譜系差異，IL－4和IL－6升高提示Th2細胞介導的體液免疫異常，但IFN－γ的升高與前者相比更為顯著，細胞因子IFN－γ由CD4+T細胞、CD8+T細胞和NK細胞產生，其誘導各種抗原提呈細胞分泌IL－12，激活巨噬細胞，促進MHC分子表達，刺激Th1細胞亞群分化，同時抑制Th2細胞亞群，在移植中介導排斥反應，是Th1細胞活化誘導細胞免疫的重要細胞因子，其可誘導CTL成熟并且加強其細胞毒作用，在機體免疫應答中發(fā)揮重要作用［5－7］。病例組 IL－4、IL －6、IFN － γ 的差異顯示IRH/IRP一方面可以通過Th2導致自身性抗體的產生，一方面可由IFN－γ升高引起的Th1細胞免疫異常并導致在部分患者骨髓中觀察到異常活躍的細胞免疫損傷現(xiàn)象。IFN－γ水平升高可增強細胞免疫殺傷力，但同時也對自身組織細胞產生破壞作用，誘導自身免疫性疾病的發(fā)生。這提示IRH/IRP中存在IFN－γ誘導并激活Th1細胞亞群，并進一步引起IRH/IRP的骨髓造血細胞免疫損傷過程，細胞免疫在IRH/IRP的發(fā)生進程中同樣有重要意義。

IRH/IRP患者外周血清細胞因子間的升高率和相關性也顯著不同于正常對照人群，IL－4與IFN－γ正相關，提示存在細胞免疫和體液免疫的同時活化，IL－2和IL－6等調節(jié)性細胞因子可對Th細胞亞群進行雙向調節(jié)，其含量變化提示了患者體內Th1、Th2和Treg等Th細胞亞群免疫網絡通過相互抑制、相互制約和相互促進從而達到新的免疫平衡的過程。分析提示IRH/IRP不僅存在體液免疫異常，由IFN－γ升高引起Th1介導的細胞免疫也被激活，進而誘導T細胞功能亢進，產生大量淋巴因子或細胞毒T細胞，攻擊吞噬自身造血細胞進而引起骨髓造血細胞發(fā)生凋亡，可能是IRH/IRP重要的致病機制。

綜上所述，本研究表明IRH/IRP是一類異質性免疫相關性疾病，該病發(fā)生發(fā)展中患者免疫功能異常，造血細胞免疫損傷的類型狀態(tài)與抗原的刺激與活化途徑、患者的遺傳背景及基因易感性有關，通過檢測血清細胞因子的變化及骨髓免疫活化的優(yōu)勢狀態(tài)，臨床上可針對患者的免疫狀況選定適當?shù)闹委煼桨负皖A防措施［8，9］。

［1］孫黎飛，韓 冰，吳強強，等．人類白細胞相關抗原B27在免疫相關性血細胞減少患者診療中的意義［J］．中華內科雜志，2012，51(7):557－559．

［2］孫黎飛，韓 冰，李 鋼，等．骨髓造血細胞島在免疫相關性血細胞減少患者中的異質性研究［J］．中國免疫學雜志，2012，28(05):458－461．

［3］和 紅，邵宗鴻，曹 增，等．骨髓單個核細胞抗人球蛋白分型實驗［J］．中華血液學雜志，2000，21(10):550－551．

［4］劉 惠，付 蓉，李麗娟，等．骨髓單核細胞Coombs試驗(+)血細胞減少癥患者有核細胞膜EPO受體與自身抗體關系的初步研究［J］．中華血液學雜志，2010，31:413－415．

［5］Youssef A R，Otley C，Mathieson PW，et al．Effectormechanisms in murine allograft rejection:comparison of skin and heartgrafts in fully allo－genetic and minor histocompatibility antigen－mismatched strain combinations［J］．Transpl Int，2002，15(6):302 －309．

［6］張 毅，儲以微．Thl7與自身免疫病［J］．復旦學報(醫(yī)學版)，2008，35(1):145 －147．

［7］劉 暢，邵 悅，鄭世民．T細胞相關細胞因子在移植排斥中的表達及意義［J］，中國免疫學雜志，2011，27(5):477－480．

［8］陳勤奮，李 佩，陳 字．免疫性血細胞減少癥常用免疫抑制劑的合理選用［J］．上海醫(yī)藥，2011，32(1):9 －12．

［9］孫黎飛，韓 冰，吳強強，等．免疫相關性血細胞減少患者骨髓造血細胞端粒酶活性檢測的臨床意義［J］．中華醫(yī)學雜志，2012，92(36):2530－2533．