黑羽番鴨GH基因多態性與體質量、屠宰性能的相關性

摘要：以黑羽番鴨為素材，利用PCR-SSCP技術尋找該群體GH基因單核苷酸多態性（SNPs），并分析SNPs與體質量、屠宰性能的關聯性。結果表明，在GH基因第1內含子上發現了A1251C、A1322G、T1378C、G1440A共4個SNP，形成了AA、AB、BB 3種基因型，群體純合度為0.502 7，多態信息含量為0.373 6。在番鴨早期生長發育過程中，BB型公鴨體質量在不同周齡時處于最高值；在13周齡屠宰時，BB型公鴨的宰前活質量、屠體質量、半凈膛質量、全凈膛質量顯著高于AA型和AB型（P<0.05）；在內臟組織中，BB型腹脂質量、心質量顯著高于AB型（P<0.05）；AA型、AB型、BB型 3種基因型間屠宰指標百分比無顯著差異（P>0.05）。母鴨所有指標在3種基因型間均無顯著差異（P>005）。這些關聯分析表明B基因可能是公鴨早期增重的有利基因，在母鴨上還需進一步驗證。

關鍵詞：黑羽番鴨；生長激素基因；體質量；屠宰性能

中圖分類號： S834.2文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0030-04

收稿日期：2013-12-04

基金項目：中國農業科學院家養動物種質資源平臺建設項目；江蘇省農業三新工程項目[編號：SXGC（2013）361]。

作者簡介：王麗華（1972—），女，遼寧營口人，碩士，副教授，主要從事家禽生產與科研工作。E-mail：jstzwlh2008@163.com。目前，水禽生長方面的功能基因研究主要是圍繞下丘腦-垂體-生長軸調節過程中的基因。生長激素（growth hormone，GH）是動物垂體前葉合成、分泌的一種單鏈蛋白類激素，具有種屬特異性，在刺激生長、促進代謝、強化其他內分泌激素方面具有重要作用，還對動物生殖功能產生影響[1]。通過對動物（包括人和畜禽）GH基因的深入研究，目前已明晰其基本結構。通常，畜禽GH分子量為21～22 ku，由186～191個氨基酸組成。動物GH基因一級結構主要有如下特點：包括人類在內的靈長類動物中，GH基因拷貝數較多；GH基因主要由5～6個外顯子和4～5個內含子所組成，且GH基因的外顯子數量和大小存在種間特異性；GH基因的cDNA長度一般為650～1 200 bp。在1988年，Chen等首次克隆獲得了820個堿基對的鴨GH基因cDNA序列，編碼216個氨基酸，含有1個27個殘基的信號肽，該序列與雞高度同源[2]。2004年GenBank上才有了鴨GH基因全序列的報道，該序列包含了 5 219個堿基對，同樣編碼216個氨基酸，包含了5個外顯子和4個內含子。雖然有了鴨GH基因全序列，但是在各個鴨品種GH基因多態性方面開展的研究工作較少，鑒于此，本試驗擬采用PCR-SSCP方法檢測黑羽番鴨GH基因序列中潛在的SNPs，并分析不同基因型間體質量、屠宰性能之間的差異，為GH基因功能研究提供參考資料。

1材料與方法

1.1試驗對象

試驗所用黑羽番鴨由江蘇農牧科技職業學院提供，選擇健康黑羽番鴨135只進行飼養，其中公鴨70羽，母鴨65羽。在初生（0周齡）及2、4、6、8、10、13周齡時測定禁食6 h后的體質量；10周齡時，從翅靜脈采血2 mL，采用肝素鈉抗凝，用于提取DNA。13周齡時，對所有黑羽番鴨進行屠宰測定，測定指標為宰前活質量、屠體質量、半凈膛質量、全凈膛質量、腿肌質量、胸肌質量、肝質量、心質量、腺肌胃質量、腹脂質量等，用公式計算出相應指標占有的比例。

1.2引物設計

根據GenBank中公布的水禽GH基因序列，設計了多對引物用于檢測黑羽番鴨群體中存在的SNPs。引物由生物公司進行合成。試驗所用引物序列及信息見表1。表1試驗所用引物序列及信息引物名稱引物序列（5′→3′）產物長度1.3DNA提取和檢測

采用酚/氯仿法抽提黑羽番鴨基因組DNA，并溶于TE中。用核酸濃度測定儀測定其濃度和純度，然后稀釋成100 ng/μL備用。

1.4PCR擴增

PCR反應物組成：10×PCR buffer（不含Mg2+） 2.5 μL、10 mmol/L dNTPs 2 μL、25 mmol/L MgCl2 1.5 μL、10 pmol/L上下游引物各1 μL、5 U/μL Taq酶0.2 μL、100 ng/μL DNA模板1 μL，加ddH2O至25 μL。

PCR擴增條件：94 ℃預變性5 min；94 ℃ 30 s，54～56 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，共35個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.5PCR產物檢測及分型

PCR產物在1.2%瓊脂糖凝膠中電泳，結束后用凝膠成像系統檢測擴增結果。條帶單一清楚、長度大小符合的產物才能用12%非變性聚丙烯酰胺凝膠進行電泳分離。點樣前樣品需要進行處理形成單鏈，經過5 V/cm的電壓電泳過夜后，用銀染顯色，然后進行基因型分析。

1.6測序

挑選純合基因型的PCR產物進行切膠回收，連接到PMD18-T載體上轉化到大腸桿菌DH5α上，經過大量繁殖后，通過鑒定后提取質粒送公司進行測序分析。

1.7統計分析

測序所得序列通過DNAMAN軟件進行比對獲得不同基因型之間具體的序列差異。采用SPSS 13.0軟件中單因素方差法分析不同基因型之間體質量和屠宰性能的差異。

2結果與分析

2.1SSCP檢測結果

以黑羽番鴨基因組DNA為模板與所設計的6對引物分別進行PCR擴增，擴增產物用1.2%瓊脂糖凝膠檢測，擴增片段與預期大小一致且特異性好，方可用于SSCP分析。

在SSCP結果分析中發現，只有引物GH16擴增的片段可以檢測到多態，聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染結果見圖1。由圖1可知，在黑羽番鴨群體中共檢測到3種基因型，純合子定義為AA、BB，雜合子定義為AB。

2.2不同純合基因型的克隆和測序

取AA、BB基因型多個PCR產物進行回收、克隆、測序。AA和BB基因型之間序列比較發現，存在4個單核苷酸變異，均位于第1內含子，分別為第1 251位點A-C突變、第 1 322 位點A-G突變、第1 378位點T-C突變、第1 440位點G-A突變（圖2）。

2.3不同基因型（基因）頻率在黑羽番鴨群體中的分布

在引物GH16檢測到的不同基因型在黑羽番鴨群體中分布情況見表2。由表2可知，雜合子AB型基因型頻率最高，為0.614 8；AA型次之，為0.229 6；BB型最低，為0.155 6。A等位基因頻率比B等位基因頻率高0.074 0。

表2引物GH16不同基因型及等位基因在黑羽番鴨群體中的分布

素材樣本量

（羽）基因型頻率等位基因頻率AAABBBAB黑羽番鴨1350.229 6 0.614 8 0.155 6 0.537 0 0.463 0

2.4遺傳特性分析

根據GH基因突變位點等位基因頻率可推算出黑羽番鴨群體平均純合度為0.502 7，雜合度為0.497 3，多態性信息含量為0.373 6（表3）。

2.5生產性能與多態位點的關聯性分析

2.5.1GH16多態位點對體質量性能的影響由表4可知，BB型公鴨體質量在所有時間點均處于最高值，初生時BB型公鴨體質量顯著性高于AA型；在4、6、8周齡時3種基因型間體質量無顯著差異；在2、10、13周齡時，BB型體質量顯著性高于AA、AB型，AA與AB型之間無顯著差異。除0周齡外，其他各周齡母鴨均以BB型體質量處于最高值；母鴨各周齡不同基因型之間均無顯著性差異。表4引物GH16不同基因型間體質量比較

2.5.2GH16多態位點對屠宰性能的影響由表5可知，BB型公鴨活質量、屠體質量、半凈膛質量、全凈膛質量均顯著高于AA型、AB型；胸肌質量、腿肌質量、肝質量在3種基因型間無顯著差異；BB型腹脂質量、心質量顯著高于AB型，AA型與BB型、AB型無顯著差異；BB型腺肌胃質量顯著高于AA型，AB型與AA型、BB型無顯著差異。

10個屠宰質量指標在母鴨3種基因型之間均無顯著差異。表5引物GH16不同基因型間屠宰性能質量比較

3討論

目前已經開展了大量畜禽關于GH基因多態方面的研究，結果表明其存在大量的多態位點，以豬GH基因多態性研究成效最為顯著。在豬GH基因5′端、編碼閱讀框和3′端序列中總計26個SNPs，18個在內含子上，6個在外顯子2中，1個在外顯子3中，1個在外顯子4中，某些SNPs對豬生產性能有顯著性影響[3-7]。牛GH基因多態性研究主要是分析其對產奶量、乳脂率、乳蛋白的影響程度[8-10]。在禽類上，雞GH基因在禽類上研究較早[11-15]，鴨研究處于相對落后階段，尚有許多工作需要開展。許盛海等在鴨中檢測到了11個點突變，分別為5′調控區序列2個，外顯子4序列中1個，內含子2序列中7個，內含子3序列中1個[16-17]。鄒劍敏等在GH基因外顯子上第3 01位點發現了C-T突變，分析了這個突變點對血漿中低密度脂蛋白（LDL-C）含量具有顯著影響[18]。吉文林等在我國6 個地方鴨品種中檢測到了GH基因1個C-T突變，位于外顯子4中，分析了該突變在不同鴨群中的分布情況[19]；伍革民等應用PCR-SSCP技術分析了5個品種鴨GH基因潛在的點突變，檢測序列覆蓋了5′和3′調控區及部分外顯子和內含子，共發現了5個多態位點[20]；李慧芳等發現GH基因第4外顯子C3701T 的突變對高郵鴨最長連產天數和雙黃率有顯著相關[21]。

本試驗設計了6對引物，其中引物GH16出現了多態位點，在第1內含子上發現了4個SNP，分別為G945A、T1039G、A1251C和A1322G，形成了3個基因型，分別為AA型、AB型、BB型。2個等位基因的頻率較為接近，黑羽番鴨的純合度為0.502 7，多態信息含量為0.373 6，說明黑羽番鴨該位點上群體呈現中等多態。在雜合度越大、PIC越高的群體中遺傳變異的程度就越大，在選育過程中可進行選擇的潛力越大；以此類推，在雜合度越小、PIC越低的群體中遺傳變異的程度就越小，對群體進行選擇的潛力就越小。黑羽番鴨處于中等水平，說明對GH基因該位點還有選擇空間。公鴨13周齡BB型的體質量（同宰前活質量）、屠體質量、半凈膛質量、全凈膛質量顯著高于AA型和AB型，3種基因型的胸肌質量與腿肌質量差異不顯著；在內臟器官組織中，BB型腹脂質量、心質量顯著高于AB型；AA型、AB型、BB型 3種基因型間屠宰指標百分比無顯著差異；母鴨所有指標在3種基因型間均無顯著差異。畜禽的生產性能是由內在遺傳因素和外在環境因素共同作用的結果，不同性別的鴨在其內在因素的影響下，可導致同一基因在性別之間所起作用效果存在差異，導致最終所起作用不同。

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