豬流行性腹瀉病毒流行毒株COE基因的原核表達及免疫原性分析

霍軍++宋予震++董青

摘要：應(yīng)用RT-PCR方法從PEDV流行毒株中擴增COE基因，并將其克隆至原核表達載體pET-32a，構(gòu)建 pET-32a-COE 重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21（DE3）中，加入IPTG進行誘導(dǎo)表達。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，該重組蛋白獲得了表達，主要以包涵體形式存在，分子量約為35.5 ku；Western-blot分析結(jié)果顯示，所表達的重組蛋白能與抗PEDV小鼠血清反應(yīng)。應(yīng)用純化的重組蛋白加入弗氏佐劑免疫6周齡BALB/C小鼠并采集血清，ELISA檢測抗體效價達1 ∶3 200以上，說明所表達的蛋白具有良好的免疫原性。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；COE基因；原核表達；免疫原性；診斷抗原；PED基因工程疫苗

中圖分類號： S858.285.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0034-02

收稿日期：2013-12-03

基金項目：2013年度河南省科技計劃（編號：132102110147）。

作者簡介：霍軍（1962—），男，河南信陽人，副教授，研究方向為動物解剖生理。Tel：（0371）65765528；E-mail：huojun@tom.com。豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起，臨床上以豬的急性腸炎、嘔吐、腹瀉、脫水以及哺乳仔豬的高死亡率為特征[1]。由于PEDV感染所引起的疾病與豬傳染性胃腸炎在臨床上難以區(qū)分，因此，對于PED的鑒別診斷往往需要借助實驗室手段。

S蛋白是冠狀病毒囊膜上的糖蛋白，負責(zé)病毒的吸附、融合和侵入宿主細胞，也是誘導(dǎo)宿主體液免疫反應(yīng)的免疫原性蛋白。目前研制的冠狀病毒基因工程疫苗所選取的抗原基因主要集中在S基因上[2-4]。Chang等報道，豬流行性腹瀉病毒S基因存在中和抗原表位（COE），Brl/87株的COE基因為S基因序列的1 495～1 914 bp[5]；而韓國PEDV株的COE基因為S基因序列的1 504～1 923 bp[6]。本試驗結(jié)合上述文獻，成功擴增了PEDV流行毒株CH/HNZZ/13株S基因的 1 474～1 950 bp 處（包括COE基因），將其連接至pET-32a原核表達質(zhì)粒進行表達，進而探討將原核表達的重組COE蛋白作為診斷抗原的可行性；并為PED基因工程疫苗的研制提供參考。

1材料與方法

1.1PEDV陽性樣本

2013年采集于河南省鄭州郊區(qū)某豬場PEDV陽性糞便樣本，命名為CH/HNZZ/13株。

1.2主要試劑

rTaq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T載體、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、RNA酶抑制劑（Rnase Inhibitor）、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購自大連寶生物工程有限公司；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購自TIANGEN公司；TRIzon Regent、 Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒、DAB顯色試劑盒購自康為世紀生物科技有限公司。

1.3PCR引物的設(shè)計

參考PEDV CV777株全基因序列（GenBank：AF 353511）設(shè)計1對特異性引物，上游引物為CGGATCCCTTCTGAGTCACGAACAG，加入酶切位點BamHⅠ；下游引物為CCTCGAGGGTACACACATCCAGAGTCAT，加入酶切位點XhoⅠ。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4樣本處理及RNA的提取

將糞便樣本用PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）進行10倍稀釋并研磨，8 000 r/min離心10 min取上清備用，參照說明書使用TRIzon Regent提取RNA。

1.5反轉(zhuǎn)錄與PEDV S基因片段的擴增

20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：RNA模板10 μL，5×buffer 4 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，下游引物1 μL（20 pmol/μL），RNase抑制劑（40 U/μL）0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（200 U/μL）0.5 μL，補加滅菌雙蒸水至20 μL；反應(yīng)條件為：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。50 μL PCR擴增體系：10×buffer 5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）5 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，rTaq DNA聚合酶（5U/μL）0.5 μL，上、下游引物（20 pmol/μL）各1 μL，補加滅菌雙蒸水至50 μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min；然后94 ℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后再72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進行電泳，回收目的片段連接至pMD18-T載體，陽性重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-COE。

1.6pET-32a-COE重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達

使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對pET-32a空質(zhì)粒和pMD18-T-COE進行雙酶切，回收目的片段，并使用T4 DNA連接酶進行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細胞中，對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和PCR鑒定，陽性重組質(zhì)粒命名為pET-32a-COE。將陽性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21（DE3）中，在菌液D600 nm值為0.6～0.8時加入終濃度為1 mmol/mL的IPTG（Isopropylthio-β-D-galactoside），37 ℃條件下進行誘導(dǎo)表達。取誘導(dǎo)后的菌液1 mL于10 000 r/min離心5 min收集沉淀，加入細菌裂解液將其混勻后使用超聲波破碎菌體，破碎完全后10 000 r/min離心5 min后，分別取上清和沉淀加入適量的2×SDS凝膠上樣緩沖液后沸水煮 5 min，然后再8 000 r/min離心5 min后取上清進行SDS- PAGE電泳分析，檢測目的蛋白的表達形式。

1.7目的蛋白純化、定量及Western-blot分析

使用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對目的蛋白進行定量分析。然后將純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，與抗PEDV小鼠陽性血清反應(yīng)，再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG進行作用，最后使用DAB進行顯色觀察。

1.8目的蛋白的動物免疫試驗及ELISA檢測

取6周齡左右昆明鼠20只，分成2組，每組10只。試驗組小鼠第一次免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏完全佐劑；2周后進行二免，每只小鼠免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏不完全佐劑；2周后三免，方法與二免相同。對照組在3次免疫時均注射0.1 mL生理鹽水。三免后2周小鼠眼球采血進行ELISA檢測，使用的ELISA方法為本實驗室建立的基于PEDV全病毒包被的抗體檢測ELISA。

2結(jié)果與分析

2.1pET-32a-COE重組質(zhì)粒構(gòu)建

通過RT-PCR方法擴增PEDV COE基因，連接至pET-32a原核表達質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和PCR鑒定，結(jié)果雙酶切鑒定時在5 900 bp和491 bp左右有2條帶，PCR鑒定時在491 bp有1條特異性條帶（圖1），表明重組pET-32a-COE質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2融合蛋白的誘導(dǎo)和純化

對含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21進行誘導(dǎo)表達，經(jīng) SDS-PAGE 電泳分析，重組表達質(zhì)粒在E.coli BL21中以包涵體蛋白的形式表達，其相對分子質(zhì)量約為35.5 ku，與預(yù)測大小相符。使用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，SDS-PAGE顯示純化后蛋白在35.5 ku處有單一條帶（圖2），說明回收純化效果較好；將重組蛋白進行復(fù)性，然后使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對重組蛋白進行定量，蛋白濃度為0.21 mg/mL。

2.3表達產(chǎn)物的Western-blot分析

以純化的重組蛋白為抗原，以抗PEDV小鼠陽性血清為一抗進行Western-blot檢測，結(jié)果在35.5 ku處出現(xiàn)l條清晰的反應(yīng)條帶，說明重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達并具有生物學(xué)活性（圖2）。

2.4重組蛋白的免疫原性分析

采用基于PEDV全病毒包被的抗體檢測ELISA方法檢測重組蛋白免疫小鼠后的血清抗體產(chǎn)生情況。ELISA檢測結(jié)果表明，在重組蛋白中加入弗氏佐劑免疫小鼠，在三免后2周試驗組小鼠的血清中ELISA抗體效價可達1 ∶3200，而對照組未檢測到PED抗體。

3討論

本試驗成功構(gòu)建pET32-a-COE重組質(zhì)粒并進行誘導(dǎo)表達，結(jié)果顯示目的蛋白主要以包涵體形式存在。雖然以包涵體形式表達的蛋白有一定缺點，主要是對包涵體的處理要先變性溶解后再進行復(fù)性，才能得到溶解的具有活性的蛋白，且復(fù)性后蛋白活性容易降低；但它也有很大的優(yōu)點，能夠避免細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶的作用，而且有利于目的蛋白的富集和分離純化，適合大規(guī)模商品化生產(chǎn)。本研究使用的pET-32a原核表達載體本身帶有His標簽，可以在變性條件下用 Ni-Agarose His 標簽蛋白純化試劑盒進行目的蛋白的純化，然后再經(jīng)復(fù)性處理獲得具有活性的目的蛋白。將純化的蛋白進行SDS-PAGE分析后顯示在35.5 ku處出現(xiàn)單一條帶，未見雜帶，說明對目的蛋白純化效果良好。Western-blot分析結(jié)果顯示，所表達的重組蛋白能與抗PEDV全病毒小鼠陽性血清反應(yīng)，表明所表達的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以作為診斷抗原用于PEDV抗體的檢測。另外，將純化的重組蛋白加入弗氏佐劑后免疫小鼠，可誘使小鼠機體產(chǎn)生高水平的PED抗體，說明所表達的蛋白具有良好的免疫原性。

目前，由PEDV感染所引起的腹瀉疫情在我國仍然十分嚴重，因此，急需建立可靠的PEDV抗體檢測方法用于PED流行病學(xué)的監(jiān)測以及豬群免疫PED疫苗后抗體水平的檢測。本試驗表達的針對PEDV COE基因主要抗原區(qū)的重組蛋白表達量高、反應(yīng)原性好，為PEDV抗體檢測試劑盒的研發(fā)提供了參考。另外，由于所表達的蛋白具有良好的免疫原性，也為將該蛋白作為PED基因工程疫苗候選抗原的研究提供依據(jù)。

參考文獻：

[1]Debouck P，Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus，CV 777[J]. Am J Vet Res，1980，41（2）： 219-223.

[2]Liu R Y，Wu L Z，Huang B J，et al. Adenoviral expression of a truncated S1 subunit of SARS- CoV spike protein results in specific humoral immune responses against SARS-CoV in rats[J]. Virus Res，2005，112（1/2）：24-31.

[3]韋顯凱，侯繼波，姜平. 表達豬流行性腹瀉病毒S基因片段重組腺病毒的構(gòu)建與免疫特性[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2008，28（10）：1128-1132.

[4]董麗娜，高鳳山，許崇波，等. 表達豬流行性腹瀉病毒COE基因的重組乳酸菌的構(gòu)建與鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39（12）：1743-1747.

[5]Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Mol Cells，2002，14（2）： 295-299.

[6]Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants Protein[J]. Expression and Purification，2005，41（2）：378-383.

王志強，俞紅賢，荊海霞，等. 牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表達蛋白生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：36-39.

1.7目的蛋白純化、定量及Western-blot分析

使用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對目的蛋白進行定量分析。然后將純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，與抗PEDV小鼠陽性血清反應(yīng)，再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG進行作用，最后使用DAB進行顯色觀察。

1.8目的蛋白的動物免疫試驗及ELISA檢測

取6周齡左右昆明鼠20只，分成2組，每組10只。試驗組小鼠第一次免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏完全佐劑；2周后進行二免，每只小鼠免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏不完全佐劑；2周后三免，方法與二免相同。對照組在3次免疫時均注射0.1 mL生理鹽水。三免后2周小鼠眼球采血進行ELISA檢測，使用的ELISA方法為本實驗室建立的基于PEDV全病毒包被的抗體檢測ELISA。

2結(jié)果與分析

2.1pET-32a-COE重組質(zhì)粒構(gòu)建

通過RT-PCR方法擴增PEDV COE基因，連接至pET-32a原核表達質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和PCR鑒定，結(jié)果雙酶切鑒定時在5 900 bp和491 bp左右有2條帶，PCR鑒定時在491 bp有1條特異性條帶（圖1），表明重組pET-32a-COE質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2融合蛋白的誘導(dǎo)和純化

對含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21進行誘導(dǎo)表達，經(jīng) SDS-PAGE 電泳分析，重組表達質(zhì)粒在E.coli BL21中以包涵體蛋白的形式表達，其相對分子質(zhì)量約為35.5 ku，與預(yù)測大小相符。使用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，SDS-PAGE顯示純化后蛋白在35.5 ku處有單一條帶（圖2），說明回收純化效果較好；將重組蛋白進行復(fù)性，然后使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對重組蛋白進行定量，蛋白濃度為0.21 mg/mL。

2.3表達產(chǎn)物的Western-blot分析

以純化的重組蛋白為抗原，以抗PEDV小鼠陽性血清為一抗進行Western-blot檢測，結(jié)果在35.5 ku處出現(xiàn)l條清晰的反應(yīng)條帶，說明重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達并具有生物學(xué)活性（圖2）。

2.4重組蛋白的免疫原性分析

采用基于PEDV全病毒包被的抗體檢測ELISA方法檢測重組蛋白免疫小鼠后的血清抗體產(chǎn)生情況。ELISA檢測結(jié)果表明，在重組蛋白中加入弗氏佐劑免疫小鼠，在三免后2周試驗組小鼠的血清中ELISA抗體效價可達1 ∶3200，而對照組未檢測到PED抗體。

3討論

本試驗成功構(gòu)建pET32-a-COE重組質(zhì)粒并進行誘導(dǎo)表達，結(jié)果顯示目的蛋白主要以包涵體形式存在。雖然以包涵體形式表達的蛋白有一定缺點，主要是對包涵體的處理要先變性溶解后再進行復(fù)性，才能得到溶解的具有活性的蛋白，且復(fù)性后蛋白活性容易降低；但它也有很大的優(yōu)點，能夠避免細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶的作用，而且有利于目的蛋白的富集和分離純化，適合大規(guī)模商品化生產(chǎn)。本研究使用的pET-32a原核表達載體本身帶有His標簽，可以在變性條件下用 Ni-Agarose His 標簽蛋白純化試劑盒進行目的蛋白的純化，然后再經(jīng)復(fù)性處理獲得具有活性的目的蛋白。將純化的蛋白進行SDS-PAGE分析后顯示在35.5 ku處出現(xiàn)單一條帶，未見雜帶，說明對目的蛋白純化效果良好。Western-blot分析結(jié)果顯示，所表達的重組蛋白能與抗PEDV全病毒小鼠陽性血清反應(yīng)，表明所表達的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以作為診斷抗原用于PEDV抗體的檢測。另外，將純化的重組蛋白加入弗氏佐劑后免疫小鼠，可誘使小鼠機體產(chǎn)生高水平的PED抗體，說明所表達的蛋白具有良好的免疫原性。

目前，由PEDV感染所引起的腹瀉疫情在我國仍然十分嚴重，因此，急需建立可靠的PEDV抗體檢測方法用于PED流行病學(xué)的監(jiān)測以及豬群免疫PED疫苗后抗體水平的檢測。本試驗表達的針對PEDV COE基因主要抗原區(qū)的重組蛋白表達量高、反應(yīng)原性好，為PEDV抗體檢測試劑盒的研發(fā)提供了參考。另外，由于所表達的蛋白具有良好的免疫原性，也為將該蛋白作為PED基因工程疫苗候選抗原的研究提供依據(jù)。

參考文獻：

[1]Debouck P，Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus，CV 777[J]. Am J Vet Res，1980，41（2）： 219-223.

[2]Liu R Y，Wu L Z，Huang B J，et al. Adenoviral expression of a truncated S1 subunit of SARS- CoV spike protein results in specific humoral immune responses against SARS-CoV in rats[J]. Virus Res，2005，112（1/2）：24-31.

[3]韋顯凱，侯繼波，姜平. 表達豬流行性腹瀉病毒S基因片段重組腺病毒的構(gòu)建與免疫特性[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2008，28（10）：1128-1132.

[4]董麗娜，高鳳山，許崇波，等. 表達豬流行性腹瀉病毒COE基因的重組乳酸菌的構(gòu)建與鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39（12）：1743-1747.

[5]Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Mol Cells，2002，14（2）： 295-299.

[6]Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants Protein[J]. Expression and Purification，2005，41（2）：378-383.

王志強，俞紅賢，荊海霞，等. 牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表達蛋白生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：36-39.

1.7目的蛋白純化、定量及Western-blot分析

使用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對目的蛋白進行定量分析。然后將純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，與抗PEDV小鼠陽性血清反應(yīng)，再加入辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠IgG進行作用，最后使用DAB進行顯色觀察。

1.8目的蛋白的動物免疫試驗及ELISA檢測

取6周齡左右昆明鼠20只，分成2組，每組10只。試驗組小鼠第一次免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏完全佐劑；2周后進行二免，每只小鼠免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏不完全佐劑；2周后三免，方法與二免相同。對照組在3次免疫時均注射0.1 mL生理鹽水。三免后2周小鼠眼球采血進行ELISA檢測，使用的ELISA方法為本實驗室建立的基于PEDV全病毒包被的抗體檢測ELISA。

2結(jié)果與分析

2.1pET-32a-COE重組質(zhì)粒構(gòu)建

通過RT-PCR方法擴增PEDV COE基因，連接至pET-32a原核表達質(zhì)粒。對重組質(zhì)粒進行雙酶切鑒定和PCR鑒定，結(jié)果雙酶切鑒定時在5 900 bp和491 bp左右有2條帶，PCR鑒定時在491 bp有1條特異性條帶（圖1），表明重組pET-32a-COE質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2融合蛋白的誘導(dǎo)和純化

對含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21進行誘導(dǎo)表達，經(jīng) SDS-PAGE 電泳分析，重組表達質(zhì)粒在E.coli BL21中以包涵體蛋白的形式表達，其相對分子質(zhì)量約為35.5 ku，與預(yù)測大小相符。使用Ni-Agarose His標簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，SDS-PAGE顯示純化后蛋白在35.5 ku處有單一條帶（圖2），說明回收純化效果較好；將重組蛋白進行復(fù)性，然后使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對重組蛋白進行定量，蛋白濃度為0.21 mg/mL。

2.3表達產(chǎn)物的Western-blot分析

以純化的重組蛋白為抗原，以抗PEDV小鼠陽性血清為一抗進行Western-blot檢測，結(jié)果在35.5 ku處出現(xiàn)l條清晰的反應(yīng)條帶，說明重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達并具有生物學(xué)活性（圖2）。

2.4重組蛋白的免疫原性分析

采用基于PEDV全病毒包被的抗體檢測ELISA方法檢測重組蛋白免疫小鼠后的血清抗體產(chǎn)生情況。ELISA檢測結(jié)果表明，在重組蛋白中加入弗氏佐劑免疫小鼠，在三免后2周試驗組小鼠的血清中ELISA抗體效價可達1 ∶3200，而對照組未檢測到PED抗體。

3討論

本試驗成功構(gòu)建pET32-a-COE重組質(zhì)粒并進行誘導(dǎo)表達，結(jié)果顯示目的蛋白主要以包涵體形式存在。雖然以包涵體形式表達的蛋白有一定缺點，主要是對包涵體的處理要先變性溶解后再進行復(fù)性，才能得到溶解的具有活性的蛋白，且復(fù)性后蛋白活性容易降低；但它也有很大的優(yōu)點，能夠避免細胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶的作用，而且有利于目的蛋白的富集和分離純化，適合大規(guī)模商品化生產(chǎn)。本研究使用的pET-32a原核表達載體本身帶有His標簽，可以在變性條件下用 Ni-Agarose His 標簽蛋白純化試劑盒進行目的蛋白的純化，然后再經(jīng)復(fù)性處理獲得具有活性的目的蛋白。將純化的蛋白進行SDS-PAGE分析后顯示在35.5 ku處出現(xiàn)單一條帶，未見雜帶，說明對目的蛋白純化效果良好。Western-blot分析結(jié)果顯示，所表達的重組蛋白能與抗PEDV全病毒小鼠陽性血清反應(yīng)，表明所表達的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以作為診斷抗原用于PEDV抗體的檢測。另外，將純化的重組蛋白加入弗氏佐劑后免疫小鼠，可誘使小鼠機體產(chǎn)生高水平的PED抗體，說明所表達的蛋白具有良好的免疫原性。

目前，由PEDV感染所引起的腹瀉疫情在我國仍然十分嚴重，因此，急需建立可靠的PEDV抗體檢測方法用于PED流行病學(xué)的監(jiān)測以及豬群免疫PED疫苗后抗體水平的檢測。本試驗表達的針對PEDV COE基因主要抗原區(qū)的重組蛋白表達量高、反應(yīng)原性好，為PEDV抗體檢測試劑盒的研發(fā)提供了參考。另外，由于所表達的蛋白具有良好的免疫原性，也為將該蛋白作為PED基因工程疫苗候選抗原的研究提供依據(jù)。

參考文獻：

[1]Debouck P，Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus，CV 777[J]. Am J Vet Res，1980，41（2）： 219-223.

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[3]韋顯凱，侯繼波，姜平. 表達豬流行性腹瀉病毒S基因片段重組腺病毒的構(gòu)建與免疫特性[J]. 中國獸醫(yī)學(xué)報，2008，28（10）：1128-1132.

[4]董麗娜，高鳳山，許崇波，等. 表達豬流行性腹瀉病毒COE基因的重組乳酸菌的構(gòu)建與鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報，2008，39（12）：1743-1747.

[5]Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Mol Cells，2002，14（2）： 295-299.

[6]Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants Protein[J]. Expression and Purification，2005，41（2）：378-383.

王志強，俞紅賢，荊海霞，等. 牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表達蛋白生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：36-39.