豬流行性腹瀉病毒流行毒株COE基因的原核表達(dá)及免疫原性分析

霍軍++宋予震++董青

摘要：應(yīng)用RT-PCR方法從PEDV流行毒株中擴(kuò)增COE基因，并將其克隆至原核表達(dá)載體pET-32a，構(gòu)建 pET-32a-COE 重組質(zhì)粒。將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21（DE3）中，加入IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。SDS-PAGE分析結(jié)果顯示，該重組蛋白獲得了表達(dá)，主要以包涵體形式存在，分子量約為35.5 ku；Western-blot分析結(jié)果顯示，所表達(dá)的重組蛋白能與抗PEDV小鼠血清反應(yīng)。應(yīng)用純化的重組蛋白加入弗氏佐劑免疫6周齡BALB/C小鼠并采集血清，ELISA檢測(cè)抗體效價(jià)達(dá)1 ∶3 200以上，說(shuō)明所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性。

關(guān)鍵詞：豬流行性腹瀉病毒；COE基因；原核表達(dá)；免疫原性；診斷抗原；PED基因工程疫苗

中圖分類(lèi)號(hào)： S858.285.3文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0034-02

收稿日期：2013-12-03

基金項(xiàng)目：2013年度河南省科技計(jì)劃（編號(hào)：132102110147）。

作者簡(jiǎn)介：霍軍（1962—），男，河南信陽(yáng)人，副教授，研究方向?yàn)閯?dòng)物解剖生理。Tel：（0371）65765528；E-mail：huojun@tom.com。豬流行性腹瀉（porcine epidemic diarrhea，PED）由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起，臨床上以豬的急性腸炎、嘔吐、腹瀉、脫水以及哺乳仔豬的高死亡率為特征[1]。由于PEDV感染所引起的疾病與豬傳染性胃腸炎在臨床上難以區(qū)分，因此，對(duì)于PED的鑒別診斷往往需要借助實(shí)驗(yàn)室手段。

S蛋白是冠狀病毒囊膜上的糖蛋白，負(fù)責(zé)病毒的吸附、融合和侵入宿主細(xì)胞，也是誘導(dǎo)宿主體液免疫反應(yīng)的免疫原性蛋白。目前研制的冠狀病毒基因工程疫苗所選取的抗原基因主要集中在S基因上[2-4]。Chang等報(bào)道，豬流行性腹瀉病毒S基因存在中和抗原表位（COE），Brl/87株的COE基因?yàn)镾基因序列的1 495～1 914 bp[5]；而韓國(guó)PEDV株的COE基因?yàn)镾基因序列的1 504～1 923 bp[6]。本試驗(yàn)結(jié)合上述文獻(xiàn)，成功擴(kuò)增了PEDV流行毒株CH/HNZZ/13株S基因的 1 474～1 950 bp 處（包括COE基因），將其連接至pET-32a原核表達(dá)質(zhì)粒進(jìn)行表達(dá)，進(jìn)而探討將原核表達(dá)的重組COE蛋白作為診斷抗原的可行性；并為PED基因工程疫苗的研制提供參考。

1材料與方法

1.1PEDV陽(yáng)性樣本

2013年采集于河南省鄭州郊區(qū)某豬場(chǎng)PEDV陽(yáng)性糞便樣本，命名為CH/HNZZ/13株。

1.2主要試劑

rTaq DNA聚合酶、dNTP、pMD18-T載體、鼠源反轉(zhuǎn)錄酶（M-MLV）、RNA酶抑制劑（Rnase Inhibitor）、T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ均購(gòu)自大連寶生物工程有限公司；Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒購(gòu)自TIANGEN公司；TRIzon Regent、 Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒、DAB顯色試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.3PCR引物的設(shè)計(jì)

參考PEDV CV777株全基因序列（GenBank：AF 353511）設(shè)計(jì)1對(duì)特異性引物，上游引物為CGGATCCCTTCTGAGTCACGAACAG，加入酶切位點(diǎn)BamHⅠ；下游引物為CCTCGAGGGTACACACATCCAGAGTCAT，加入酶切位點(diǎn)XhoⅠ。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.4樣本處理及RNA的提取

將糞便樣本用PBS（0.01 mol/L，pH值7.2）進(jìn)行10倍稀釋并研磨，8 000 r/min離心10 min取上清備用，參照說(shuō)明書(shū)使用TRIzon Regent提取RNA。

1.5反轉(zhuǎn)錄與PEDV S基因片段的擴(kuò)增

20 μL反轉(zhuǎn)錄體系：RNA模板10 μL，5×buffer 4 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，下游引物1 μL（20 pmol/μL），RNase抑制劑（40 U/μL）0.5 μL，反轉(zhuǎn)錄酶M-MLV（200 U/μL）0.5 μL，補(bǔ)加滅菌雙蒸水至20 μL；反應(yīng)條件為：42 ℃ 1 h，95 ℃ 5 min。50 μL PCR擴(kuò)增體系：10×buffer 5 μL，MgCl2（25 mmol/μL）5 μL，反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物（cDNA）5 μL，dNTP（10 mmol/L）1 μL，rTaq DNA聚合酶（5U/μL）0.5 μL，上、下游引物（20 pmol/μL）各1 μL，補(bǔ)加滅菌雙蒸水至50 μL。反應(yīng)循環(huán)參數(shù)：95 ℃ 5 min；然后94 ℃ 1 min，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，30個(gè)循環(huán)；循環(huán)結(jié)束后再72 ℃ 10 min。PCR產(chǎn)物使用1%瓊脂糖凝膠進(jìn)行電泳，回收目的片段連接至pMD18-T載體，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pMD18-T-COE。

1.6pET-32a-COE重組質(zhì)粒的構(gòu)建及表達(dá)

使用限制性內(nèi)切酶BamHⅠ和XhoⅠ對(duì)pET-32a空質(zhì)粒和pMD18-T-COE進(jìn)行雙酶切，回收目的片段，并使用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定，陽(yáng)性重組質(zhì)粒命名為pET-32a-COE。將陽(yáng)性重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21（DE3）中，在菌液D600 nm值為0.6～0.8時(shí)加入終濃度為1 mmol/mL的IPTG（Isopropylthio-β-D-galactoside），37 ℃條件下進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。取誘導(dǎo)后的菌液1 mL于10 000 r/min離心5 min收集沉淀，加入細(xì)菌裂解液將其混勻后使用超聲波破碎菌體，破碎完全后10 000 r/min離心5 min后，分別取上清和沉淀加入適量的2×SDS凝膠上樣緩沖液后沸水煮 5 min，然后再8 000 r/min離心5 min后取上清進(jìn)行SDS- PAGE電泳分析，檢測(cè)目的蛋白的表達(dá)形式。

1.7目的蛋白純化、定量及Western-blot分析

使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量分析。然后將純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，與抗PEDV小鼠陽(yáng)性血清反應(yīng)，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG進(jìn)行作用，最后使用DAB進(jìn)行顯色觀察。

1.8目的蛋白的動(dòng)物免疫試驗(yàn)及ELISA檢測(cè)

取6周齡左右昆明鼠20只，分成2組，每組10只。試驗(yàn)組小鼠第一次免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏完全佐劑；2周后進(jìn)行二免，每只小鼠免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏不完全佐劑；2周后三免，方法與二免相同。對(duì)照組在3次免疫時(shí)均注射0.1 mL生理鹽水。三免后2周小鼠眼球采血進(jìn)行ELISA檢測(cè)，使用的ELISA方法為本實(shí)驗(yàn)室建立的基于PEDV全病毒包被的抗體檢測(cè)ELISA。

2結(jié)果與分析

2.1pET-32a-COE重組質(zhì)粒構(gòu)建

通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增PEDV COE基因，連接至pET-32a原核表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定，結(jié)果雙酶切鑒定時(shí)在5 900 bp和491 bp左右有2條帶，PCR鑒定時(shí)在491 bp有1條特異性條帶（圖1），表明重組pET-32a-COE質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2融合蛋白的誘導(dǎo)和純化

對(duì)含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng) SDS-PAGE 電泳分析，重組表達(dá)質(zhì)粒在E.coli BL21中以包涵體蛋白的形式表達(dá)，其相對(duì)分子質(zhì)量約為35.5 ku，與預(yù)測(cè)大小相符。使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，SDS-PAGE顯示純化后蛋白在35.5 ku處有單一條帶（圖2），說(shuō)明回收純化效果較好；將重組蛋白進(jìn)行復(fù)性，然后使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)重組蛋白進(jìn)行定量，蛋白濃度為0.21 mg/mL。

2.3表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析

以純化的重組蛋白為抗原，以抗PEDV小鼠陽(yáng)性血清為一抗進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果在35.5 ku處出現(xiàn)l條清晰的反應(yīng)條帶，說(shuō)明重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)并具有生物學(xué)活性（圖2）。

2.4重組蛋白的免疫原性分析

采用基于PEDV全病毒包被的抗體檢測(cè)ELISA方法檢測(cè)重組蛋白免疫小鼠后的血清抗體產(chǎn)生情況。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，在重組蛋白中加入弗氏佐劑免疫小鼠，在三免后2周試驗(yàn)組小鼠的血清中ELISA抗體效價(jià)可達(dá)1 ∶3200，而對(duì)照組未檢測(cè)到PED抗體。

3討論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建pET32-a-COE重組質(zhì)粒并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示目的蛋白主要以包涵體形式存在。雖然以包涵體形式表達(dá)的蛋白有一定缺點(diǎn)，主要是對(duì)包涵體的處理要先變性溶解后再進(jìn)行復(fù)性，才能得到溶解的具有活性的蛋白，且復(fù)性后蛋白活性容易降低；但它也有很大的優(yōu)點(diǎn)，能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶的作用，而且有利于目的蛋白的富集和分離純化，適合大規(guī)模商品化生產(chǎn)。本研究使用的pET-32a原核表達(dá)載體本身帶有His標(biāo)簽，可以在變性條件下用 Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行目的蛋白的純化，然后再經(jīng)復(fù)性處理獲得具有活性的目的蛋白。將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析后顯示在35.5 ku處出現(xiàn)單一條帶，未見(jiàn)雜帶，說(shuō)明對(duì)目的蛋白純化效果良好。Western-blot分析結(jié)果顯示，所表達(dá)的重組蛋白能與抗PEDV全病毒小鼠陽(yáng)性血清反應(yīng)，表明所表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以作為診斷抗原用于PEDV抗體的檢測(cè)。另外，將純化的重組蛋白加入弗氏佐劑后免疫小鼠，可誘使小鼠機(jī)體產(chǎn)生高水平的PED抗體，說(shuō)明所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性。

目前，由PEDV感染所引起的腹瀉疫情在我國(guó)仍然十分嚴(yán)重，因此，急需建立可靠的PEDV抗體檢測(cè)方法用于PED流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)以及豬群免疫PED疫苗后抗體水平的檢測(cè)。本試驗(yàn)表達(dá)的針對(duì)PEDV COE基因主要抗原區(qū)的重組蛋白表達(dá)量高、反應(yīng)原性好，為PEDV抗體檢測(cè)試劑盒的研發(fā)提供了參考。另外，由于所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性，也為將該蛋白作為PED基因工程疫苗候選抗原的研究提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Debouck P，Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus，CV 777[J]. Am J Vet Res，1980，41（2）： 219-223.

[2]Liu R Y，Wu L Z，Huang B J，et al. Adenoviral expression of a truncated S1 subunit of SARS- CoV spike protein results in specific humoral immune responses against SARS-CoV in rats[J]. Virus Res，2005，112（1/2）：24-31.

[3]韋顯凱，侯繼波，姜平. 表達(dá)豬流行性腹瀉病毒S基因片段重組腺病毒的構(gòu)建與免疫特性[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，28（10）：1128-1132.

[4]董麗娜，高鳳山，許崇波，等. 表達(dá)豬流行性腹瀉病毒COE基因的重組乳酸菌的構(gòu)建與鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（12）：1743-1747.

[5]Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Mol Cells，2002，14（2）： 295-299.

[6]Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants Protein[J]. Expression and Purification，2005，41（2）：378-383.

王志強(qiáng)，俞紅賢，荊海霞，等. 牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表達(dá)蛋白生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：36-39.

1.7目的蛋白純化、定量及Western-blot分析

使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量分析。然后將純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，與抗PEDV小鼠陽(yáng)性血清反應(yīng)，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG進(jìn)行作用，最后使用DAB進(jìn)行顯色觀察。

1.8目的蛋白的動(dòng)物免疫試驗(yàn)及ELISA檢測(cè)

取6周齡左右昆明鼠20只，分成2組，每組10只。試驗(yàn)組小鼠第一次免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏完全佐劑；2周后進(jìn)行二免，每只小鼠免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏不完全佐劑；2周后三免，方法與二免相同。對(duì)照組在3次免疫時(shí)均注射0.1 mL生理鹽水。三免后2周小鼠眼球采血進(jìn)行ELISA檢測(cè)，使用的ELISA方法為本實(shí)驗(yàn)室建立的基于PEDV全病毒包被的抗體檢測(cè)ELISA。

2結(jié)果與分析

2.1pET-32a-COE重組質(zhì)粒構(gòu)建

通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增PEDV COE基因，連接至pET-32a原核表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定，結(jié)果雙酶切鑒定時(shí)在5 900 bp和491 bp左右有2條帶，PCR鑒定時(shí)在491 bp有1條特異性條帶（圖1），表明重組pET-32a-COE質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2融合蛋白的誘導(dǎo)和純化

對(duì)含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng) SDS-PAGE 電泳分析，重組表達(dá)質(zhì)粒在E.coli BL21中以包涵體蛋白的形式表達(dá)，其相對(duì)分子質(zhì)量約為35.5 ku，與預(yù)測(cè)大小相符。使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，SDS-PAGE顯示純化后蛋白在35.5 ku處有單一條帶（圖2），說(shuō)明回收純化效果較好；將重組蛋白進(jìn)行復(fù)性，然后使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)重組蛋白進(jìn)行定量，蛋白濃度為0.21 mg/mL。

2.3表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析

以純化的重組蛋白為抗原，以抗PEDV小鼠陽(yáng)性血清為一抗進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果在35.5 ku處出現(xiàn)l條清晰的反應(yīng)條帶，說(shuō)明重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)并具有生物學(xué)活性（圖2）。

2.4重組蛋白的免疫原性分析

采用基于PEDV全病毒包被的抗體檢測(cè)ELISA方法檢測(cè)重組蛋白免疫小鼠后的血清抗體產(chǎn)生情況。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，在重組蛋白中加入弗氏佐劑免疫小鼠，在三免后2周試驗(yàn)組小鼠的血清中ELISA抗體效價(jià)可達(dá)1 ∶3200，而對(duì)照組未檢測(cè)到PED抗體。

3討論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建pET32-a-COE重組質(zhì)粒并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示目的蛋白主要以包涵體形式存在。雖然以包涵體形式表達(dá)的蛋白有一定缺點(diǎn)，主要是對(duì)包涵體的處理要先變性溶解后再進(jìn)行復(fù)性，才能得到溶解的具有活性的蛋白，且復(fù)性后蛋白活性容易降低；但它也有很大的優(yōu)點(diǎn)，能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶的作用，而且有利于目的蛋白的富集和分離純化，適合大規(guī)模商品化生產(chǎn)。本研究使用的pET-32a原核表達(dá)載體本身帶有His標(biāo)簽，可以在變性條件下用 Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行目的蛋白的純化，然后再經(jīng)復(fù)性處理獲得具有活性的目的蛋白。將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析后顯示在35.5 ku處出現(xiàn)單一條帶，未見(jiàn)雜帶，說(shuō)明對(duì)目的蛋白純化效果良好。Western-blot分析結(jié)果顯示，所表達(dá)的重組蛋白能與抗PEDV全病毒小鼠陽(yáng)性血清反應(yīng)，表明所表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以作為診斷抗原用于PEDV抗體的檢測(cè)。另外，將純化的重組蛋白加入弗氏佐劑后免疫小鼠，可誘使小鼠機(jī)體產(chǎn)生高水平的PED抗體，說(shuō)明所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性。

目前，由PEDV感染所引起的腹瀉疫情在我國(guó)仍然十分嚴(yán)重，因此，急需建立可靠的PEDV抗體檢測(cè)方法用于PED流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)以及豬群免疫PED疫苗后抗體水平的檢測(cè)。本試驗(yàn)表達(dá)的針對(duì)PEDV COE基因主要抗原區(qū)的重組蛋白表達(dá)量高、反應(yīng)原性好，為PEDV抗體檢測(cè)試劑盒的研發(fā)提供了參考。另外，由于所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性，也為將該蛋白作為PED基因工程疫苗候選抗原的研究提供依據(jù)。

參考文獻(xiàn)：

[1]Debouck P，Pensaert M. Experimental infection of pigs with a new porcine enteric coronavirus，CV 777[J]. Am J Vet Res，1980，41（2）： 219-223.

[2]Liu R Y，Wu L Z，Huang B J，et al. Adenoviral expression of a truncated S1 subunit of SARS- CoV spike protein results in specific humoral immune responses against SARS-CoV in rats[J]. Virus Res，2005，112（1/2）：24-31.

[3]韋顯凱，侯繼波，姜平. 表達(dá)豬流行性腹瀉病毒S基因片段重組腺病毒的構(gòu)建與免疫特性[J]. 中國(guó)獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，28（10）：1128-1132.

[4]董麗娜，高鳳山，許崇波，等. 表達(dá)豬流行性腹瀉病毒COE基因的重組乳酸菌的構(gòu)建與鑒定[J]. 畜牧獸醫(yī)學(xué)報(bào)，2008，39（12）：1743-1747.

[5]Chang S H，Bae J L，Kang T J，et al. Identification of the epitope region capable of inducing neutralizing antibodies against the porcine epidemic diarrhea virus[J]. Mol Cells，2002，14（2）： 295-299.

[6]Kang T J，Seo J E，Kim D H，et al. Cloning and sequence analysis of the Korean strain of spike gene of porcine epidemic diarrhea virus and expression of its neutralizing epitope in plants Protein[J]. Expression and Purification，2005，41（2）：378-383.

王志強(qiáng)，俞紅賢，荊海霞，等. 牦牛SLC25A6基因的CDS序列及其表達(dá)蛋白生物信息學(xué)分析[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2014，42（9）：36-39.

1.7目的蛋白純化、定量及Western-blot分析

使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)目的蛋白進(jìn)行定量分析。然后將純化的目的蛋白經(jīng)SDS-PAGE電泳后轉(zhuǎn)印到PVDF膜上，與抗PEDV小鼠陽(yáng)性血清反應(yīng)，再加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗鼠IgG進(jìn)行作用，最后使用DAB進(jìn)行顯色觀察。

1.8目的蛋白的動(dòng)物免疫試驗(yàn)及ELISA檢測(cè)

取6周齡左右昆明鼠20只，分成2組，每組10只。試驗(yàn)組小鼠第一次免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏完全佐劑；2周后進(jìn)行二免，每只小鼠免疫50 μg的重組蛋白加等量的弗氏不完全佐劑；2周后三免，方法與二免相同。對(duì)照組在3次免疫時(shí)均注射0.1 mL生理鹽水。三免后2周小鼠眼球采血進(jìn)行ELISA檢測(cè)，使用的ELISA方法為本實(shí)驗(yàn)室建立的基于PEDV全病毒包被的抗體檢測(cè)ELISA。

2結(jié)果與分析

2.1pET-32a-COE重組質(zhì)粒構(gòu)建

通過(guò)RT-PCR方法擴(kuò)增PEDV COE基因，連接至pET-32a原核表達(dá)質(zhì)粒。對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定和PCR鑒定，結(jié)果雙酶切鑒定時(shí)在5 900 bp和491 bp左右有2條帶，PCR鑒定時(shí)在491 bp有1條特異性條帶（圖1），表明重組pET-32a-COE質(zhì)粒構(gòu)建成功。

2.2融合蛋白的誘導(dǎo)和純化

對(duì)含有重組質(zhì)粒的E.coli BL21進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng) SDS-PAGE 電泳分析，重組表達(dá)質(zhì)粒在E.coli BL21中以包涵體蛋白的形式表達(dá)，其相對(duì)分子質(zhì)量約為35.5 ku，與預(yù)測(cè)大小相符。使用Ni-Agarose His標(biāo)簽蛋白純化試劑盒純化目的蛋白，SDS-PAGE顯示純化后蛋白在35.5 ku處有單一條帶（圖2），說(shuō)明回收純化效果較好；將重組蛋白進(jìn)行復(fù)性，然后使用Bradford蛋白質(zhì)定量試劑盒對(duì)重組蛋白進(jìn)行定量，蛋白濃度為0.21 mg/mL。

2.3表達(dá)產(chǎn)物的Western-blot分析

以純化的重組蛋白為抗原，以抗PEDV小鼠陽(yáng)性血清為一抗進(jìn)行Western-blot檢測(cè)，結(jié)果在35.5 ku處出現(xiàn)l條清晰的反應(yīng)條帶，說(shuō)明重組蛋白在大腸桿菌中得到了正確表達(dá)并具有生物學(xué)活性（圖2）。

2.4重組蛋白的免疫原性分析

采用基于PEDV全病毒包被的抗體檢測(cè)ELISA方法檢測(cè)重組蛋白免疫小鼠后的血清抗體產(chǎn)生情況。ELISA檢測(cè)結(jié)果表明，在重組蛋白中加入弗氏佐劑免疫小鼠，在三免后2周試驗(yàn)組小鼠的血清中ELISA抗體效價(jià)可達(dá)1 ∶3200，而對(duì)照組未檢測(cè)到PED抗體。

3討論

本試驗(yàn)成功構(gòu)建pET32-a-COE重組質(zhì)粒并進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，結(jié)果顯示目的蛋白主要以包涵體形式存在。雖然以包涵體形式表達(dá)的蛋白有一定缺點(diǎn)，主要是對(duì)包涵體的處理要先變性溶解后再進(jìn)行復(fù)性，才能得到溶解的具有活性的蛋白，且復(fù)性后蛋白活性容易降低；但它也有很大的優(yōu)點(diǎn)，能夠避免細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)水解酶的作用，而且有利于目的蛋白的富集和分離純化，適合大規(guī)模商品化生產(chǎn)。本研究使用的pET-32a原核表達(dá)載體本身帶有His標(biāo)簽，可以在變性條件下用 Ni-Agarose His 標(biāo)簽蛋白純化試劑盒進(jìn)行目的蛋白的純化，然后再經(jīng)復(fù)性處理獲得具有活性的目的蛋白。將純化的蛋白進(jìn)行SDS-PAGE分析后顯示在35.5 ku處出現(xiàn)單一條帶，未見(jiàn)雜帶，說(shuō)明對(duì)目的蛋白純化效果良好。Western-blot分析結(jié)果顯示，所表達(dá)的重組蛋白能與抗PEDV全病毒小鼠陽(yáng)性血清反應(yīng)，表明所表達(dá)的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性，可以作為診斷抗原用于PEDV抗體的檢測(cè)。另外，將純化的重組蛋白加入弗氏佐劑后免疫小鼠，可誘使小鼠機(jī)體產(chǎn)生高水平的PED抗體，說(shuō)明所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性。

目前，由PEDV感染所引起的腹瀉疫情在我國(guó)仍然十分嚴(yán)重，因此，急需建立可靠的PEDV抗體檢測(cè)方法用于PED流行病學(xué)的監(jiān)測(cè)以及豬群免疫PED疫苗后抗體水平的檢測(cè)。本試驗(yàn)表達(dá)的針對(duì)PEDV COE基因主要抗原區(qū)的重組蛋白表達(dá)量高、反應(yīng)原性好，為PEDV抗體檢測(cè)試劑盒的研發(fā)提供了參考。另外，由于所表達(dá)的蛋白具有良好的免疫原性，也為將該蛋白作為PED基因工程疫苗候選抗原的研究提供依據(jù)。

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