抗鹽玫瑰組培快繁體系的建立

李雪　馬媛春　程宗明

摘要：以抗鹽玫瑰當年生去葉的幼嫩單芽莖段為試驗材料，建立體外無性快繁體系。結果表明，適宜玫瑰離體腋芽發芽的最佳培養基配方為MS+0.5 mg/L 6-BA和MS+1.5 mg/L 6-BA；適宜叢生芽繼代增殖的最佳培養基配方為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA和3/4MS+0.3 mg/L IBA；適宜組培苗生根的最佳培養基配方為1/2MS+03 mg/L NAA，其生根率可達95%。生根苗木移栽成活率可達87%以上。該體系可以用于抗鹽玫瑰的快速大量繁殖。

關鍵詞：抗鹽玫瑰；組培快繁體系；培養基；萌發；繼代培養；生根誘導；移栽馴化

中圖分類號： S685.120.4+3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0050-04

收稿日期：2014-04-05

基金項目：江蘇省農業科技自主創新資金[編號：CX（14）2051]。

作者簡介：李雪（1987—），女，山東德州人，碩士研究生，主要從事園藝植物生物技術研究。E-mail：smilexueok@163.com。

通信作者：程宗明，博士，教授，主要從事果實系統生物學研究。E-mail：zmc@njau.edu.cn。玫瑰（Rosa rugosa L.）是薔薇科薔薇屬植物，廣泛分布在東亞、歐洲和北美洲地區。它花型秀美，色彩艷麗，氣味芳香，形色俱佳。玫瑰花朵主要用于提煉香精玫瑰油，玫瑰油比等重量黃金價值還高，主要應用于化妝品、食品、精細化工等。玫瑰花瓣還可直接被腌制成食品，作調味劑使用，同時它的干燥花蕾也是一種重要的傳統中藥材[1]。經測定，玫瑰的果實中含有大量的維生素A、維生素B、維生素C，還含有10多種氨基酸、可溶性糖、生物堿和無機元素等[2-4]。常食玫瑰果可以預防冠心病、肝病、急慢性傳染病和阻止產生致癌物質等。玫瑰果實還常常被用來制作成濃縮維生素制劑。此外，玫瑰還具有較強的抗逆性[5]。玫瑰種子發芽慢，扦插繁殖困難，采用組織培養的方法繁殖玫瑰，不但生產周期短，繁殖系數高，而且成本低，經濟效益很高。江蘇省東部沿海灘涂鹽堿濃度高，極少園林和觀賞植物能夠在此生長。近幾年來，筆者試種的一些抗鹽玫瑰單株具有較強耐鹽能力，利用這些耐鹽單株建立玫瑰離體快繁體系，是實現良種快繁以及產業化發展的客觀需求。

1材料與方法

1.1試驗材料

該供試材料為當年生實生苗，種子來自美國海濱，經過3個月沙藏保存后于翌年3月初播種，其盛花期見圖1。

1.2方法

1.2.1外植體的消毒處理3月中旬從優良健壯植株剪取當年生枝條中段帶芽的幼嫩莖段，用毛刷蘸取洗衣粉水輕輕刷洗后，剪成5.0 cm左右莖條，再流水沖洗2 h左右。在超凈工作臺上，先將莖段用70%乙醇溶液消毒30 s，用無菌水沖洗2～3次，然后置于0.1%HgCl2溶液中消毒3～5 min，再用無菌水沖洗3～5次。用無菌濾紙吸干材料表面的水分，最后將幼嫩莖條剪切成1.0 cm左右的帶芽莖段，接種[6]。

1.2.2腋芽的萌發誘導將已處理的無菌莖段接種于腋芽誘導培養基上進行誘導培養。基本誘導培養基為MS培養基，對基本培養基添加不同濃度的細胞分裂素6-BA（6-benzylaminopurine，6-芐氨基腺嘌呤）、大量元素和有機元素，共組成5種配方的培養基：MS+0.5 mg/L 6-BA、MS+1.5 mg/L 6-BA、MS+2.5 mg/L 6-BA、3/2MS+2.5 mg/L 6-BA、MS+2.5 mg/L 6-BA（有機元素為1.5倍）。每種培養基上均接種30個離體莖段，每個處理重復3次，首先暗培養處理5 d，以減輕外植體的褐化現象[7-9]，培養4周后統計腋芽萌發率。

1.2.3繼代增殖培養將誘導培養基上已經萌發的嫩芽剪切下來轉接到繼代培養基上生長，共設8種繼代培養基：MS+ 0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA、MS+1.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA、MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA、MS+0.5 mg/L 6-BA+01 mg/L NAA、MS+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L NAA、MS+0.3 mg/L IBA、3/4MS+0.3 mg/L IBA。每種培養基均接種20個0.5～1.0 cm長的單芽莖段，每個處理重復3次，培養30 d后，統計莖高≥2.0 cm的苗的數量。

1.2.4生根培養從繼代培養苗中選取生長健壯的幼苗，轉接到生根培養基上，共組成5種生根培養基：1/2MS+0.1 mg/L NAA、1/2MS+0.3 mg/L NAA、1/2MS+0.5 mg/L NAA、1/2MS+0.3 mg/L IBA、1/2MS+0.4 mg/L IBA。每種培養基均接種20個幼苗，每個處理重復3次，接種20 d后統計幼苗的生根情況。

1.2.5組培苗的馴化移栽

1.2.5.1組培苗的馴化將長勢良好、株高5.0 cm以上的生根組培苗的瓶蓋擰松，放置5 d后開始每天倒入約3 mm厚的無菌水并逐漸開蓋，7 d后時徹底揭開瓶蓋，在持續該環境下觀察3 d。擰松瓶蓋后須每天添加無菌水，這樣不但能夠防止培養基被徹底風干，還能為組培苗補充適當的水分。

1.2.5.2組培苗的移栽將長勢依舊健壯且無污染的幼苗用鑷子從組培瓶中小心取出，再用無菌水輕輕將附著的培養基洗掉，注意不要傷根。同時剪掉幼苗基部葉片，僅保留頂端3～5張復葉，再移栽到光照培養箱中。移栽所用的基質先121 ℃、30 min高壓蒸汽滅菌，基質中蛭石 ∶草炭土 ∶珍珠巖為9 ∶3 ∶1.5，移栽完畢后澆透水，并用0.1%多菌靈溶液噴霧保苗。培養箱溫度設置為22 ℃，晝夜溫差2～3 ℃，相對濕度為90%，光照強度為100 μmol/（m2·s），光照時間為12 h/d，其間噴水2～3次/d，同時注意防治病菌。移栽5 d后可以增加光照強度并且適當降低澆水量[10]。

1.2.6統計分析數據分析采用Excel和SPSS軟件進行。

2結果與分析

2.1離體芽的誘導

之前預試驗中采芽時間分別為3月中旬、5月中旬、7月中旬、9月中旬、10月中旬，結果以3月采芽試驗效果最好，因此正式試驗都采用3月的取樣。玫瑰離體莖段接種2周后離體芽幾乎全部萌發，但芽萌動后的生長狀況卻因培養基內生長調節劑濃度的不同而表現出差異。由表1可以看出，MS+2.5 mg/L 6-BA培養基上叢生芽少，節間極短，芽苗矮小；3/2MS+2.5 mg/L 6-BA培養基上分化率達157%，但節間極短；培養基MS+2.5 mg/L 6-BA（有機元素為1.5倍）上，叢生芽最少，節間短，芽苗矮小。以上3種培養基上芽苗均長勢矮壯，說明細胞分裂素6-BA濃度過高反而會抑制生長[11]，增加大量元素含量和有機元素含量也并不利于玫瑰腋芽萌發。培養基MS+1.5 mg/L 6-BA和MS+0.5 mg/L 6-BA上分化率都高達170%，與其他處理差異顯著，叢生芽多且生長健壯，雖然6-BA濃度為0.5 mg/L時莖稈稍細，但是并不影響其繼代生長。重復試驗篩選出適宜離體芽誘導分化的培養基配方為MS+0.5 mg/L 6-BA（圖2）和MS+1.5 mg/L 6-BA（圖3）。

2.2叢生芽的繼代培養

繼代增殖培養基采用的生長素為NAA（1-nnaphthaleneacetic acid，萘乙酸）和IBA（3-indolebutyricacid，3-吲哚丁酸）。玫瑰在8種繼代增殖培養基上培養4周后，芽的增殖倍數和生長情況存在差異。由表2可以看出，玫瑰在培養基MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L NAA和培養基MS+0.5 mg/L 6-BA +0.3 mg/L NAA上分別于3、5 d后開始出現葉片萎蔫現象，不久后死亡，說明生長素NAA和6-BA的組合并不適合這種玫瑰的繼代增殖培養。玫瑰在培養基MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA上增殖倍數高達3.6，與其他處理差異顯著，叢生芽多且生長健壯；MS+0.5 mg/L 6-BA+0.1 mg/L IBA培養基上叢生芽少且有畸形苗；MS+0.5 mg/L 6-BA +0.3 mg/L IBA培養基上叢生芽少，葉粗厚變脆；MS+1.5 mg/L 6-BA +0.1 mg/L IBA 培養基上叢生芽最少，節間極短，苗叢密集，微型化。說明細胞分裂素和生長素的用量及配比對玫瑰的繼代增殖都有重要影響。MS+0.3 mg/L IBA培養基上叢生芽較少，速度慢，個別苗生長細弱，而3/4MS+0.3 mg/L IBA培養基上增殖倍數高達3.8，與其他處理差異顯著，叢生芽多且生長健壯，說明調節大量元素含量可有效提高繁殖系數。重復試驗篩選出適宜玫瑰繼代增殖的培養基配方為MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA（圖4）和3/4MS+0.3 mg/L IBA（圖5）。

2.3組培苗的生根培養

由表3可以明顯看出，生長素NAA較IBA對抗鹽玫瑰的組培誘導生根誘導效果更好。培養基1/2MS+0.1 mg/L NAA和1/2MS+0.3 mg/L IBA上組培苗生根率均為50%，平均根數分別為4條和5條，并且根系粗短；1/2MS+0.4 mg/L IBA培養基上組培苗生根率達75%，平均根數約為3.33條，雖然這種培養基比IBA濃度為0.3 mg/L時根系稍長，但由于根系細弱也不適于移栽（圖6）；在培養基1/2MS + 0.3 mg/L NAA和培養基1/2MS+0.5 mg/L NAA上，組培苗生根率均高達95%，與其他處理差異顯著，但是隨著NAA濃度升高，

平均生根數反而減少，因此NAA濃度為0.5 mg/L時并不適合誘導生根。

在中間繁殖體增殖到一定數量即開始進行生根培養，由于嫩莖中細胞分裂素的累積，在轉入生根培養基后增殖的趨勢往往仍然很強，幾乎沒有不定根的發生。因此，生根培養要降低細胞分裂素濃度，增加生長素濃度[12-13]。重復試驗篩選出誘導玫瑰組培苗生根的最佳培養基配方為1/2MS+0.3 mg/L NAA（圖7），且根系良好，適于移栽。

2.4組培苗的馴化移栽

玫瑰組培苗馴化移栽15 d后，就可以過渡到正常溫室或自然條件下生長（圖8）。經重復試驗發現，只要按照上述程

3結論與討論

在抗鹽玫瑰的腋芽誘導時期，以MS+0.5 mg/L 6-BA和MS+1.5 mg/L 6-BA這2種培養基配方的效果最佳；在繼代與增殖時期，以MS+1.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L IBA和3/4MS+0.3 mg/L IBA這2種培養基的效果最佳；在組培苗的誘導生根時期，以1/2MS+0.3 mg/L NAA培養基的效果最佳。

在玫瑰的繼代增殖培養階段發現，不同生長調節劑的配比是影響叢生芽繼代增殖的關鍵。生長素IBA與6-BA結合比NAA與6-BA結合更加適合這種玫瑰的繼代增殖培養。然而在玫瑰的生根培養中，生長素NAA卻比IBA更利于促進玫瑰的生根，應用生長素IBA誘導的根普遍細弱。因此不同的生長階段對生長調節劑的需求不同。

采用組織培養的方法繁殖玫瑰，生產周期短，整個周期僅4個月，且繁殖系數高，成本低，應有很高的經濟效益和社會效益。另外，組培快繁技術可以保證種苗生長一致，并且能夠克服種子繁殖苗木所帶來的觀賞性狀不一致的缺點，提高苗木的商品規格，有利于進行玫瑰的工廠化生產，為良種快繁以及產業化發展奠定基礎。本試驗建立了抗鹽玫瑰從初代、繼代到生根離體快繁的完整體系，將為工廠化生產提供依據，且該試驗大量擴繁選育的抗鹽玫瑰單株，也將于江蘇省東部沿海進行區域試驗。

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