再力花葉斑病病原菌鑒定

歐克芳　李旭旭

摘要：2008年以來，在武漢市再力花葉片上發現一種病害，該病發病初期為紅褐色針尖狀圓點，后擴展為圓形、橢圓形或不規則形，病斑中央灰白至灰褐色，斑緣紅褐色，外有黃色暈圈，病健交界明顯；發病后期病斑進一步擴展聯合成大病斑，發病嚴重的植株，多數葉片布滿病斑且干枯死亡，嚴重影響植株的光合作用和觀賞價值。從葉片上分離得到病菌，經柯赫氏法則驗證，鑒定該病原菌為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Keirssler]。該病菌為害再力花引起葉斑病在國內尚屬首次報道。

關鍵詞：再力花；葉斑病；病原鑒定；鏈格孢菌

中圖分類號： S436.8+1文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0113-02

收稿日期：2013-11-20

基金項目：湖北省武漢市建委項目（編號：武建2008-92）；武漢市園林局項目（編號：武園2008-17）。

作者簡介：歐克芳（1980—），女，湖北公安人，碩士，工程師，研究方向為濕地植物病蟲害。E-mail：oukefang@163.com。再力花（Thalia dealbata）別名水竹芋，為竹芋科再力花屬多年生宿根挺水草本，原產于美國南部和墨西哥[1]。再力花植株高大美觀，碩大的葉片翠綠可愛，花序高出葉面，亭亭玉立；花朵素雅別致，是一種觀賞價值極高的挺水花卉。再力花除有很高的觀賞價值外，還有較好的吸附重金屬、凈化水質的作用[2-3]，近年被新引入我國并被廣泛應用于濕地或公園水景，可配置香蒲、千屈菜、荷花等形成獨特的水體景觀，也可盆栽觀賞或種植于庭院水體景觀中。2008—2012年，在武漢市解放公園和月湖公園等再力花種植區進行調查時，發現再力花葉病斑發生普遍，嚴重影響其觀賞價值，目前，國內尚未見再力花病害的研究報道。本研究對再力花葉病斑病原物進行分離、鑒定，以期明確病原菌，為該病害的防治提供理論依據。

1材料與方法

1.1病原菌的分離與培養

2012年4—11月，對武漢市解放公園、月湖公園、武漢植物園及武漢市園林科學研究所水生池種植區的再力花葉斑病發生和為害情況進行調查，并對田間病株出現的癥狀進行描述并拍照。采集典型病葉，用常規的組織分離法分離病葉：切取發病典型的再力花葉片病健交界處5 mm×5 mm的組織，先在70%乙醇中消毒5 s，再置于0.1% HgCl2中消毒1 min，無菌水漂洗3～4次，接種到PDA培養基（馬鈴薯200 g、葡萄糖15 g、瓊脂15 g、水1 000 mL）中，于25 ℃恒溫培養箱中培養 3 d，挑取組織塊周圍的菌落轉皿進行純化，獲得的純菌種保存于PDA斜面，置4 ℃冰箱中保存備用。

1.2致病性測定

將病原菌接種到PDA平板上活化，25 ℃條件下12 h光照、12 h黑暗交替培養10 d，用無菌水洗下分生孢子，配制成1×106個/mL的孢子懸浮液，選取健康再力花葉片，分別采用直接懸滴法和針刺懸滴法接種。接種前用無菌水將再力花表面蠟粉洗凈，葉片每側接種5～6個點，每個點接種約8 μL孢子懸浮液，以滴加8 μL無菌水的葉片為對照。每組接種30張葉片，重復3次，觀察發病情況。

1.3病原菌形態觀察

1.3.1病原菌菌落觀察活化病原菌，從菌落邊緣取直徑 5 mm 病原菌菌絲塊分別置于PDA培養基和PCA培養基（馬鈴薯20 g、胡蘿卜20 g、瓊脂15 g、水1 000 mL）中，25 ℃培養，觀察病原菌在2種培養基上的菌落形態、大小、色素類型。

1.3.2PCA培養基上病菌形態觀察將病菌接種到PCA培養基平板上，25 ℃條件下12 h光照、12 h黑暗交替培養 5 d，在顯微鏡下觀察分生孢子梗與分生孢子形態，并用目鏡測微尺測量分生孢子及分生孢子梗大小。

1.3.3病原菌產孢表型觀察參照張天宇的方法[4]，將病原菌接種到PCA平板上，25 ℃下12 h光照、黑暗交替培養1周后，從菌落邊緣切取小塊菌絲塊涂在孔心10 mm的滅菌濾紙上，然后將濾紙放在滅菌載玻片上，置無菌培養皿內保濕培養5 d，取出載玻片，進行產孢表型觀察，并照相記錄。

1.3.4自然寄主上病原菌形態觀察采集田間再力花病葉，用無菌水沖洗后保濕培養48 h，挑取典型病斑上的黑色霉層制作玻片，顯微鏡下觀察分生孢子及分生孢子梗特征，測量分生孢子及分生孢子梗大小。

2結果與分析

2.1葉斑病病害癥狀

葉斑病主要危害再力花葉片，4月下旬開始發生，7—9月為發病盛期。發病初期為紅褐色針尖狀圓點，后擴展為圓形、橢圓形或不規則形，病斑中央灰白至灰褐色，斑緣紅褐色，外有黃色暈圈，病健交界明顯（圖1）。發病后期病斑進一步擴展聯合成大病斑，葉片上出現灰黑色霉狀物為病原菌子實體，葉正面多于葉背面。發病嚴重的植株，多數葉片布滿病斑且干枯死亡，嚴重影響植株的光合作用和觀賞價值。

2.2病原菌致病性測定

用真菌孢子懸浮液接種刺傷的再力花葉片，7 d后開始出現紅褐色針尖狀圓點，后病斑逐漸擴大；接種無傷的葉片

10 d后開始出現感病癥狀；患病葉片表現出的癥狀與田間自然發病癥狀相似；對照未發病。從接種后發病的葉片組織再次分離到該致病菌，這說明該致病菌為葉斑病的病原菌。

2.3病原菌的形態特征

在PDA培養基上，該病原菌菌絲初期為白色，3 d后菌落灰白色，邊緣白色，背面褐色，后逐漸轉為墨綠色至黑色，短絨狀，菌落近圓形，平展，周緣整齊（圖2）；4 d 后菌落直徑為46～49 mm，5 d后菌落直徑達55～58 mm。在PCA培養基上，菌落黑褐色，邊緣灰色，背面褐色，菌落近圓形，絨狀，平展（圖3）；4 d 后菌落直徑為42～44 mm，5 d后菌落直徑達49～52 mm。

3結論與討論

通過對采集到的再力花病葉病原菌進行分離純化，結合自然寄主和純培養，對病菌分生孢子和分生孢子梗的大小、形態、產孢特征等進行觀察，確定導致再力花葉斑病的病原菌為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Keirssler]。

當前，分子生物學方法越來越多的被應用于真菌系統學研究和分類鑒定，尤其是5.8 S rDNA及其兩側的轉錄間區ITS序列分析適用于種級水平的分類研究[5]。鏈格孢屬小孢子種之間形態差異不明顯，親緣關系接近，很難通過ITS序列分析加以區分，因此，對于小孢子種的區分仍以形態學為主。

自然寄主葉片上的鏈格孢菌和PCA培養基上產生的鏈格孢菌，兩者形態特征較為相似，這說明在PCA培養基上鑒定鏈格孢菌是可行的。鏈格孢菌在PDA培養基和PCA上菌落直徑不同，菌絲在營養豐富的PDA培養基上生長較快，在營養相對匱乏的PCA培養基上生長較慢。另外，鏈格孢菌是鏈格孢屬的模式種，也是廣布的主要小孢子鏈孢種之一，能引起多種植物病害，導致再力花發生葉斑病為首次報道。再力花葉斑病的生物學特性、侵染循環、發病規律和防治方法等有待進一步研究。

參考文獻：

[1]田軍東，史團省，朱世新，等. 引種植物水竹芋捕蟲行為的初步觀察研究[J]. 世界科技研究與發展，2007，29（3）：62-65，38.

[2]陳永華，吳曉芙，蔣麗鵑，等. 處理生活污水濕地植物的篩選與凈化潛力評價[J]. 環境科學學報，2008，28（8）：1549-1554.

[3]王驥，張蘭英，盧少勇，等. 再力花/菖蒲生物濕地床去除河水中氮磷的試驗[J]. 吉林大學學報：地球科學版，2012，42（S1）：408-414.

[4]張天宇. 中國真菌志：鏈格孢屬[M]. 北京：科學出版社，2003：19-36.

[5]Brower A V Z，Desalle R，Vogler A. Gene trees，species trees，and systematics：a cladistic perspective[J]. Ann Rev Ecol Syst，1996，27：423-450.顧麗嬙 . 殼寡糖對番茄灰霉病菌的抑制作用[J]. 江蘇農業科學，2014，42（9）：115-117.

3結論與討論

通過對采集到的再力花病葉病原菌進行分離純化，結合自然寄主和純培養，對病菌分生孢子和分生孢子梗的大小、形態、產孢特征等進行觀察，確定導致再力花葉斑病的病原菌為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Keirssler]。

當前，分子生物學方法越來越多的被應用于真菌系統學研究和分類鑒定，尤其是5.8 S rDNA及其兩側的轉錄間區ITS序列分析適用于種級水平的分類研究[5]。鏈格孢屬小孢子種之間形態差異不明顯，親緣關系接近，很難通過ITS序列分析加以區分，因此，對于小孢子種的區分仍以形態學為主。

自然寄主葉片上的鏈格孢菌和PCA培養基上產生的鏈格孢菌，兩者形態特征較為相似，這說明在PCA培養基上鑒定鏈格孢菌是可行的。鏈格孢菌在PDA培養基和PCA上菌落直徑不同，菌絲在營養豐富的PDA培養基上生長較快，在營養相對匱乏的PCA培養基上生長較慢。另外，鏈格孢菌是鏈格孢屬的模式種，也是廣布的主要小孢子鏈孢種之一，能引起多種植物病害，導致再力花發生葉斑病為首次報道。再力花葉斑病的生物學特性、侵染循環、發病規律和防治方法等有待進一步研究。

參考文獻：

[1]田軍東，史團省，朱世新，等. 引種植物水竹芋捕蟲行為的初步觀察研究[J]. 世界科技研究與發展，2007，29（3）：62-65，38.

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3結論與討論

通過對采集到的再力花病葉病原菌進行分離純化，結合自然寄主和純培養，對病菌分生孢子和分生孢子梗的大小、形態、產孢特征等進行觀察，確定導致再力花葉斑病的病原菌為鏈格孢屬鏈格孢菌[Alternaria alternate （Fr.） Keirssler]。

當前，分子生物學方法越來越多的被應用于真菌系統學研究和分類鑒定，尤其是5.8 S rDNA及其兩側的轉錄間區ITS序列分析適用于種級水平的分類研究[5]。鏈格孢屬小孢子種之間形態差異不明顯，親緣關系接近，很難通過ITS序列分析加以區分，因此，對于小孢子種的區分仍以形態學為主。

自然寄主葉片上的鏈格孢菌和PCA培養基上產生的鏈格孢菌，兩者形態特征較為相似，這說明在PCA培養基上鑒定鏈格孢菌是可行的。鏈格孢菌在PDA培養基和PCA上菌落直徑不同，菌絲在營養豐富的PDA培養基上生長較快，在營養相對匱乏的PCA培養基上生長較慢。另外，鏈格孢菌是鏈格孢屬的模式種，也是廣布的主要小孢子鏈孢種之一，能引起多種植物病害，導致再力花發生葉斑病為首次報道。再力花葉斑病的生物學特性、侵染循環、發病規律和防治方法等有待進一步研究。

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[3]王驥，張蘭英，盧少勇，等. 再力花/菖蒲生物濕地床去除河水中氮磷的試驗[J]. 吉林大學學報：地球科學版，2012，42（S1）：408-414.

[4]張天宇. 中國真菌志：鏈格孢屬[M]. 北京：科學出版社，2003：19-36.

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