紫外分光光度法測定向日葵列當中苯乙醇總苷的含量

摘要：比較了超聲波提取法、滲濾提取法、熱回流提取法等不同提取方法對向日葵列當中苯乙醇總苷的提取效果，結果表明，以熱回流方法為佳，80%乙醇回流法提取效果最好，在5.5～27.5 μg/mL范圍內線性關系良好，回收率為100.4%，RSD值為2.48%（n=5），向日葵列當中苯乙醇總苷平均含量為1.97%。

關鍵詞：向日葵列當；苯乙醇總苷；紫外分光光度法

中圖分類號： O657.32文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0282-03

收稿日期：2013-11-28

基金項目：吉林省吉林市科技計劃（編號：201162512）。

作者簡介：曲正義（1984—），男，碩士，助理研究員，從事藥效質量評價研究。E-mail：qzy209@163.com

通信作者：王英平。E-mail：lyingpingw@126.com。向日葵列當（Orobanche cumana Wallr.）別稱毒根草、兔子拐棍，為列當科（Orobanchaceae）列當屬（Orobanche）一年生寄生草本植物，在我國分布范圍很廣，主要分布于黑龍江省、吉林省、北京市、甘肅省、遼寧省、內蒙古自治區、河北省、山西省、陜西省、青海省、新疆維吾爾自治區等地區[1-2]。在我國部分地區，列當屬多種植物全草入藥，具有強筋壯骨、補腎助陽、抗疲勞、改善腦組織循環、增強免疫力等作用，其主要活性成分為苯乙醇苷類[3-5]。趙夢霞等對列當屬植物向日葵列當進行了研究，分離得到4個苯乙醇苷類化合物，分別為crenatoside、isocrenatoside、類葉升麻苷、3-O-methyl-crenatoside。其中crenatoside含量較高，crenatoside具有清除自由基、抗氧化、抗菌、抗衰老等作用[6-7]。目前，國內外對向日葵列當的研究主要以防治、根除為主，對其化學成分及藥理活性研究較少，未建立有效的藥材質量控制標準[8-10]。為了更好地開發利用向日葵列當資源，緩解素有沙漠“人參”之稱的同科植物肉蓯蓉資源日益緊缺的局面，筆者采用紫外分光光度法測定向日葵列當中苯乙醇總苷的含量，旨在為進一步開發利用向日葵列當資源提供依據。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1材料向日葵列當于2013年9月采于吉林省松原市長嶺縣，經由中國農業科學院特產研究所姚春林研究員鑒定為向日葵列當的全草。樣品經50 ℃烘干粉碎后過40目篩，密封冷藏保存備用。

1.1.2試劑蒸餾水，甲醇、無水乙醇均為分析純，crenatoside對照品由筆者所在實驗室分離純化并鑒定其結構[6]，純度>98%。

1.1.3儀器TU-1810型紫外可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司），HH-6型數顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司），N-1001型旋轉蒸發儀（上海愛朗儀器有限公司），CPA2250D電子天平（德國Sartorius集團），DHG-9145A 電熱恒溫鼓風干燥箱（上海一恒儀器科學有限公司）。

1.2方法

1.2.1對照品溶液的制備crenatoside標準儲備液：精密稱取5.50 mg標準品，置于10 mL容量瓶中，加甲醇使其溶解，稀釋至刻度，搖勻，得crenatoside濃度為0.55 mg/mL的對照品貯備試液備用。

1.2.2供試品溶液的制備

1.2.2.1超聲波提取法精密稱取向日葵列當干樣50.0 g，粉碎并過 40 目篩，置于圓底燒瓶中，以80%乙醇為提取溶劑，溶劑用量為600 mL，超聲提取3次，每次50 min，過濾，合并回收濃縮濾液，定容于100 mL容量瓶中。精密吸取1 mL供試品溶液定容至10 mL容量瓶中備用，平行提取3次。

1.2.2.2滲濾提取法精密稱取向日葵列當干樣50.0 g，粉碎并過 40 目篩，以 80%乙醇為滲漉溶劑（用量為藥材干質量的 12 倍），以 1.0 mL/min的流量滲漉24 h，過濾，合并回收濃縮濾液，定容于100 mL供試品溶液容量瓶中。精密吸取1 mL供試品溶液定容至10 mL容量瓶中備用，平行提取3次。

1.2.2.3熱回流提取法精密稱取向日葵列當干樣50.0 g，粉碎并過40目篩，置于圓底燒瓶中，加80%乙醇600 mL，加熱回流提取3次，每次1 h，過濾，合并回收濃縮濾液，定容于100 mL容量瓶中。精密吸取1 mL供試品溶液定容至10 mL容量瓶中備用，平行提取3次。根據含量結果，選擇提取苯乙醇苷含量高的方法進行供試品溶液制備。

1.2.3最大吸收波長精密吸取對照品、樣品溶液各0.4 mL置于20 mL磨口帶塞試管中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在230～400 nm處進行紫外掃描，對照品、樣品溶液均在333 nm處有最大吸收，因此確定最大吸收波長為333 nm（圖1）。

1.2.4標準曲線繪制精密吸取對照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于20 mL磨口帶塞試管中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在最大吸收波長下，以甲醇為空白，測定吸光度，以吸光度為橫坐標，以crenatoside濃度為縱坐標，繪制標準曲線，回歸方程為y=28.709x+0.995 3（r=0.999 0），表明在5.5～27.5 μg/mL范圍內crenatoside濃度與吸光度有良好的線性關系（圖2）。

1.2.5精密度試驗精密吸取對照品溶液0.4 mL置于20 mL 磨口帶塞試管中，共6份，按“1.2.4”節方法測定吸光度，連續測定6次。

1.2.6穩定性試驗精密吸取樣品溶液0.4 mL置于20 mL磨口帶塞試管中，按“1.2.4”節方法測定吸光度，每隔2 h 測定1次，共測6次。endprint

1.2.7重復性試驗精確稱取藥材粉末5份，每份50.0 g，按照“1.2.2”方法，平行制備樣品溶液，各吸取0.4 mL樣品溶液置于5個20 mL具塞試管中，按“1.2.4”節方法測定吸光度。

1.2.8加樣回收試驗精確吸取5 份已知含量樣品溶液04 mL，定容于5個20 mL具塞試管中，分別加入0.55 mg/mL crenatoside對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按“1.2.4”節方法顯色測定吸光度，計算回收率和相對標準偏差RSD值。

1.2.9 樣品的測定 精密吸取3份“1.2.2”節中樣品溶液各0.4 mL，分別定容于3個20 mL磨口帶塞試管中，按“1.2.4”節方法顯色測定吸光度，重復測定3次，取其平均值，向日葵列當中苯乙醇總苷含量計算公式如下：

苯乙醇總苷含量=稀釋倍數×C×20×10-6×100×100%/m。（1）

式中：C為樣品溶液中苯乙醇總苷的含量；m為向日葵列當樣品的干質量。

2結果與分析

2.1不同提取方法的苯乙醇總苷含量

由表1可知，熱回流提取苯乙醇總苷含量明顯高于超聲波提取法、滲濾提取法，因此本研究采用熱回流提取法。與熱回流相比，超聲波提取法、滲濾提取法具有提取時間短、無需加熱等優點，但向日葵列當中苯乙醇總苷提取率不高，這可能與苯乙醇苷類化合物的種類與結構有關。

3結論

本研究比較了超聲波提取法、滲濾提取法、熱回流提取法等不同提取方法對向日葵列當中苯乙醇總苷進行提取，結果表明，以熱回流方法為佳，80%乙醇回流法提取效果最好，在5.5～27.5 μg/mL范圍內線性關系良好，回收率為100.4%，RSD值為2.48%（n=5），向日葵列當中苯乙醇總苷平均含量為1.97%。

參考文獻：

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[7]曲正義，侯微，金銀萍，等. 向日葵列當抗氧化活性研究[J]. 中藥材，2010，33（11）：1780-1782.

[8]黃長權. 向日葵列當寄生機理的研究[D]. 哈爾濱：東北農業大學，2012.

[9]Sauerborn J，Buschmann H，Ghiasi K G，et al. Benzothiadiazole activates resistance in sunflower （Helianthus annuus） to the root-parasitic weed orobanche cuman[J]. Phytopathology，2002，92（1）：59-64.

[10]de Zélicourt A，Letousey P，Thoiron S，et al. Ha-DEF1，a sunflower defensin，induces cell death in Orobanche parasitic plants[J]. Planta，2007，226（3）：591-600.endprint

1.2.7重復性試驗精確稱取藥材粉末5份，每份50.0 g，按照“1.2.2”方法，平行制備樣品溶液，各吸取0.4 mL樣品溶液置于5個20 mL具塞試管中，按“1.2.4”節方法測定吸光度。

1.2.8加樣回收試驗精確吸取5 份已知含量樣品溶液04 mL，定容于5個20 mL具塞試管中，分別加入0.55 mg/mL crenatoside對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按“1.2.4”節方法顯色測定吸光度，計算回收率和相對標準偏差RSD值。

1.2.9 樣品的測定 精密吸取3份“1.2.2”節中樣品溶液各0.4 mL，分別定容于3個20 mL磨口帶塞試管中，按“1.2.4”節方法顯色測定吸光度，重復測定3次，取其平均值，向日葵列當中苯乙醇總苷含量計算公式如下：

苯乙醇總苷含量=稀釋倍數×C×20×10-6×100×100%/m。（1）

式中：C為樣品溶液中苯乙醇總苷的含量；m為向日葵列當樣品的干質量。

2結果與分析

2.1不同提取方法的苯乙醇總苷含量

由表1可知，熱回流提取苯乙醇總苷含量明顯高于超聲波提取法、滲濾提取法，因此本研究采用熱回流提取法。與熱回流相比，超聲波提取法、滲濾提取法具有提取時間短、無需加熱等優點，但向日葵列當中苯乙醇總苷提取率不高，這可能與苯乙醇苷類化合物的種類與結構有關。

3結論

本研究比較了超聲波提取法、滲濾提取法、熱回流提取法等不同提取方法對向日葵列當中苯乙醇總苷進行提取，結果表明，以熱回流方法為佳，80%乙醇回流法提取效果最好，在5.5～27.5 μg/mL范圍內線性關系良好，回收率為100.4%，RSD值為2.48%（n=5），向日葵列當中苯乙醇總苷平均含量為1.97%。

參考文獻：

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[10]de Zélicourt A，Letousey P，Thoiron S，et al. Ha-DEF1，a sunflower defensin，induces cell death in Orobanche parasitic plants[J]. Planta，2007，226（3）：591-600.endprint

1.2.7重復性試驗精確稱取藥材粉末5份，每份50.0 g，按照“1.2.2”方法，平行制備樣品溶液，各吸取0.4 mL樣品溶液置于5個20 mL具塞試管中，按“1.2.4”節方法測定吸光度。

1.2.8加樣回收試驗精確吸取5 份已知含量樣品溶液04 mL，定容于5個20 mL具塞試管中，分別加入0.55 mg/mL crenatoside對照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按“1.2.4”節方法顯色測定吸光度，計算回收率和相對標準偏差RSD值。

1.2.9 樣品的測定 精密吸取3份“1.2.2”節中樣品溶液各0.4 mL，分別定容于3個20 mL磨口帶塞試管中，按“1.2.4”節方法顯色測定吸光度，重復測定3次，取其平均值，向日葵列當中苯乙醇總苷含量計算公式如下：

苯乙醇總苷含量=稀釋倍數×C×20×10-6×100×100%/m。（1）

式中：C為樣品溶液中苯乙醇總苷的含量；m為向日葵列當樣品的干質量。

2結果與分析

2.1不同提取方法的苯乙醇總苷含量

由表1可知，熱回流提取苯乙醇總苷含量明顯高于超聲波提取法、滲濾提取法，因此本研究采用熱回流提取法。與熱回流相比，超聲波提取法、滲濾提取法具有提取時間短、無需加熱等優點，但向日葵列當中苯乙醇總苷提取率不高，這可能與苯乙醇苷類化合物的種類與結構有關。

3結論

本研究比較了超聲波提取法、滲濾提取法、熱回流提取法等不同提取方法對向日葵列當中苯乙醇總苷進行提取，結果表明，以熱回流方法為佳，80%乙醇回流法提取效果最好，在5.5～27.5 μg/mL范圍內線性關系良好，回收率為100.4%，RSD值為2.48%（n=5），向日葵列當中苯乙醇總苷平均含量為1.97%。

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[8]黃長權. 向日葵列當寄生機理的研究[D]. 哈爾濱：東北農業大學，2012.

[9]Sauerborn J，Buschmann H，Ghiasi K G，et al. Benzothiadiazole activates resistance in sunflower （Helianthus annuus） to the root-parasitic weed orobanche cuman[J]. Phytopathology，2002，92（1）：59-64.

[10]de Zélicourt A，Letousey P，Thoiron S，et al. Ha-DEF1，a sunflower defensin，induces cell death in Orobanche parasitic plants[J]. Planta，2007，226（3）：591-600.endprint