紫外分光光度法測(cè)定向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷的含量

摘要：比較了超聲波提取法、滲濾提取法、熱回流提取法等不同提取方法對(duì)向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷的提取效果，結(jié)果表明，以熱回流方法為佳，80%乙醇回流法提取效果最好，在5.5～27.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率為100.4%，RSD值為2.48%（n=5），向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷平均含量為1.97%。

關(guān)鍵詞：向日葵列當(dāng)；苯乙醇總苷；紫外分光光度法

中圖分類號(hào)： O657.32文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A文章編號(hào)：1002-1302（2014）09-0282-03

收稿日期：2013-11-28

基金項(xiàng)目：吉林省吉林市科技計(jì)劃（編號(hào)：201162512）。

作者簡(jiǎn)介：曲正義（1984—），男，碩士，助理研究員，從事藥效質(zhì)量評(píng)價(jià)研究。E-mail：qzy209@163.com

通信作者：王英平。E-mail：lyingpingw@126.com。向日葵列當(dāng)（Orobanche cumana Wallr.）別稱毒根草、兔子拐棍，為列當(dāng)科（Orobanchaceae）列當(dāng)屬（Orobanche）一年生寄生草本植物，在我國(guó)分布范圍很廣，主要分布于黑龍江省、吉林省、北京市、甘肅省、遼寧省、內(nèi)蒙古自治區(qū)、河北省、山西省、陜西省、青海省、新疆維吾爾自治區(qū)等地區(qū)[1-2]。在我國(guó)部分地區(qū)，列當(dāng)屬多種植物全草入藥，具有強(qiáng)筋壯骨、補(bǔ)腎助陽(yáng)、抗疲勞、改善腦組織循環(huán)、增強(qiáng)免疫力等作用，其主要活性成分為苯乙醇苷類[3-5]。趙夢(mèng)霞等對(duì)列當(dāng)屬植物向日葵列當(dāng)進(jìn)行了研究，分離得到4個(gè)苯乙醇苷類化合物，分別為crenatoside、isocrenatoside、類葉升麻苷、3-O-methyl-crenatoside。其中crenatoside含量較高，crenatoside具有清除自由基、抗氧化、抗菌、抗衰老等作用[6-7]。目前，國(guó)內(nèi)外對(duì)向日葵列當(dāng)?shù)难芯恐饕苑乐巍⒏秊橹鳎瑢?duì)其化學(xué)成分及藥理活性研究較少，未建立有效的藥材質(zhì)量控制標(biāo)準(zhǔn)[8-10]。為了更好地開發(fā)利用向日葵列當(dāng)資源，緩解素有沙漠“人參”之稱的同科植物肉蓯蓉資源日益緊缺的局面，筆者采用紫外分光光度法測(cè)定向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷的含量，旨在為進(jìn)一步開發(fā)利用向日葵列當(dāng)資源提供依據(jù)。

1材料與方法

1.1材料、試劑與儀器

1.1.1材料向日葵列當(dāng)于2013年9月采于吉林省松原市長(zhǎng)嶺縣，經(jīng)由中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所姚春林研究員鑒定為向日葵列當(dāng)?shù)娜荨悠方?jīng)50 ℃烘干粉碎后過(guò)40目篩，密封冷藏保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2試劑蒸餾水，甲醇、無(wú)水乙醇均為分析純，crenatoside對(duì)照品由筆者所在實(shí)驗(yàn)室分離純化并鑒定其結(jié)構(gòu)[6]，純度>98%。

1.1.3儀器TU-1810型紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（北京普析通用儀器有限責(zé)任公司），HH-6型數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州澳華儀器有限公司），N-1001型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海愛(ài)朗儀器有限公司），CPA2250D電子天平（德國(guó)Sartorius集團(tuán)），DHG-9145A 電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱（上海一恒儀器科學(xué)有限公司）。

1.2方法

1.2.1對(duì)照品溶液的制備crenatoside標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液：精密稱取5.50 mg標(biāo)準(zhǔn)品，置于10 mL容量瓶中，加甲醇使其溶解，稀釋至刻度，搖勻，得crenatoside濃度為0.55 mg/mL的對(duì)照品貯備試液備用。

1.2.2供試品溶液的制備

1.2.2.1超聲波提取法精密稱取向日葵列當(dāng)干樣50.0 g，粉碎并過(guò) 40 目篩，置于圓底燒瓶中，以80%乙醇為提取溶劑，溶劑用量為600 mL，超聲提取3次，每次50 min，過(guò)濾，合并回收濃縮濾液，定容于100 mL容量瓶中。精密吸取1 mL供試品溶液定容至10 mL容量瓶中備用，平行提取3次。

1.2.2.2滲濾提取法精密稱取向日葵列當(dāng)干樣50.0 g，粉碎并過(guò) 40 目篩，以 80%乙醇為滲漉溶劑（用量為藥材干質(zhì)量的 12 倍），以 1.0 mL/min的流量滲漉24 h，過(guò)濾，合并回收濃縮濾液，定容于100 mL供試品溶液容量瓶中。精密吸取1 mL供試品溶液定容至10 mL容量瓶中備用，平行提取3次。

1.2.2.3熱回流提取法精密稱取向日葵列當(dāng)干樣50.0 g，粉碎并過(guò)40目篩，置于圓底燒瓶中，加80%乙醇600 mL，加熱回流提取3次，每次1 h，過(guò)濾，合并回收濃縮濾液，定容于100 mL容量瓶中。精密吸取1 mL供試品溶液定容至10 mL容量瓶中備用，平行提取3次。根據(jù)含量結(jié)果，選擇提取苯乙醇苷含量高的方法進(jìn)行供試品溶液制備。

1.2.3最大吸收波長(zhǎng)精密吸取對(duì)照品、樣品溶液各0.4 mL置于20 mL磨口帶塞試管中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在230～400 nm處進(jìn)行紫外掃描，對(duì)照品、樣品溶液均在333 nm處有最大吸收，因此確定最大吸收波長(zhǎng)為333 nm（圖1）。

1.2.4標(biāo)準(zhǔn)曲線繪制精密吸取對(duì)照品溶液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL置于20 mL磨口帶塞試管中，用甲醇稀釋至刻度，搖勻，在最大吸收波長(zhǎng)下，以甲醇為空白，測(cè)定吸光度，以吸光度為橫坐標(biāo)，以crenatoside濃度為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，回歸方程為y=28.709x+0.995 3（r=0.999 0），表明在5.5～27.5 μg/mL范圍內(nèi)crenatoside濃度與吸光度有良好的線性關(guān)系（圖2）。

1.2.5精密度試驗(yàn)精密吸取對(duì)照品溶液0.4 mL置于20 mL 磨口帶塞試管中，共6份，按“1.2.4”節(jié)方法測(cè)定吸光度，連續(xù)測(cè)定6次。

1.2.6穩(wěn)定性試驗(yàn)精密吸取樣品溶液0.4 mL置于20 mL磨口帶塞試管中，按“1.2.4”節(jié)方法測(cè)定吸光度，每隔2 h 測(cè)定1次，共測(cè)6次。endprint

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn)精確稱取藥材粉末5份，每份50.0 g，按照“1.2.2”方法，平行制備樣品溶液，各吸取0.4 mL樣品溶液置于5個(gè)20 mL具塞試管中，按“1.2.4”節(jié)方法測(cè)定吸光度。

1.2.8加樣回收試驗(yàn)精確吸取5 份已知含量樣品溶液04 mL，定容于5個(gè)20 mL具塞試管中，分別加入0.55 mg/mL crenatoside對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按“1.2.4”節(jié)方法顯色測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值。

1.2.9 樣品的測(cè)定 精密吸取3份“1.2.2”節(jié)中樣品溶液各0.4 mL，分別定容于3個(gè)20 mL磨口帶塞試管中，按“1.2.4”節(jié)方法顯色測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值，向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷含量計(jì)算公式如下：

苯乙醇總苷含量=稀釋倍數(shù)×C×20×10-6×100×100%/m。（1）

式中：C為樣品溶液中苯乙醇總苷的含量；m為向日葵列當(dāng)樣品的干質(zhì)量。

2結(jié)果與分析

2.1不同提取方法的苯乙醇總苷含量

由表1可知，熱回流提取苯乙醇總苷含量明顯高于超聲波提取法、滲濾提取法，因此本研究采用熱回流提取法。與熱回流相比，超聲波提取法、滲濾提取法具有提取時(shí)間短、無(wú)需加熱等優(yōu)點(diǎn)，但向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷提取率不高，這可能與苯乙醇苷類化合物的種類與結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3結(jié)論

本研究比較了超聲波提取法、滲濾提取法、熱回流提取法等不同提取方法對(duì)向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷進(jìn)行提取，結(jié)果表明，以熱回流方法為佳，80%乙醇回流法提取效果最好，在5.5～27.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率為100.4%，RSD值為2.48%（n=5），向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷平均含量為1.97%。

參考文獻(xiàn)：

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[4]劉曉林，趙秀香，魏穎穎，等. 向日葵列當(dāng)粗提物對(duì)植物病原真菌的抑制作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（3）：104-105.

[5]高昂，姚默，崔超，等. 列當(dāng)屬藥學(xué)研究概況[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（33）：20394-20395.

[6]趙夢(mèng)霞. 向日葵列當(dāng)化學(xué)成分及其活性研究[D]. 哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2012.

[7]曲正義，侯微，金銀萍，等. 向日葵列當(dāng)抗氧化活性研究[J]. 中藥材，2010，33（11）：1780-1782.

[8]黃長(zhǎng)權(quán). 向日葵列當(dāng)寄生機(jī)理的研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[9]Sauerborn J，Buschmann H，Ghiasi K G，et al. Benzothiadiazole activates resistance in sunflower （Helianthus annuus） to the root-parasitic weed orobanche cuman[J]. Phytopathology，2002，92（1）：59-64.

[10]de Zélicourt A，Letousey P，Thoiron S，et al. Ha-DEF1，a sunflower defensin，induces cell death in Orobanche parasitic plants[J]. Planta，2007，226（3）：591-600.endprint

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn)精確稱取藥材粉末5份，每份50.0 g，按照“1.2.2”方法，平行制備樣品溶液，各吸取0.4 mL樣品溶液置于5個(gè)20 mL具塞試管中，按“1.2.4”節(jié)方法測(cè)定吸光度。

1.2.8加樣回收試驗(yàn)精確吸取5 份已知含量樣品溶液04 mL，定容于5個(gè)20 mL具塞試管中，分別加入0.55 mg/mL crenatoside對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按“1.2.4”節(jié)方法顯色測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值。

1.2.9 樣品的測(cè)定 精密吸取3份“1.2.2”節(jié)中樣品溶液各0.4 mL，分別定容于3個(gè)20 mL磨口帶塞試管中，按“1.2.4”節(jié)方法顯色測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值，向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷含量計(jì)算公式如下：

苯乙醇總苷含量=稀釋倍數(shù)×C×20×10-6×100×100%/m。（1）

式中：C為樣品溶液中苯乙醇總苷的含量；m為向日葵列當(dāng)樣品的干質(zhì)量。

2結(jié)果與分析

2.1不同提取方法的苯乙醇總苷含量

由表1可知，熱回流提取苯乙醇總苷含量明顯高于超聲波提取法、滲濾提取法，因此本研究采用熱回流提取法。與熱回流相比，超聲波提取法、滲濾提取法具有提取時(shí)間短、無(wú)需加熱等優(yōu)點(diǎn)，但向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷提取率不高，這可能與苯乙醇苷類化合物的種類與結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3結(jié)論

本研究比較了超聲波提取法、滲濾提取法、熱回流提取法等不同提取方法對(duì)向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷進(jìn)行提取，結(jié)果表明，以熱回流方法為佳，80%乙醇回流法提取效果最好，在5.5～27.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率為100.4%，RSD值為2.48%（n=5），向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷平均含量為1.97%。

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[8]黃長(zhǎng)權(quán). 向日葵列當(dāng)寄生機(jī)理的研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[9]Sauerborn J，Buschmann H，Ghiasi K G，et al. Benzothiadiazole activates resistance in sunflower （Helianthus annuus） to the root-parasitic weed orobanche cuman[J]. Phytopathology，2002，92（1）：59-64.

[10]de Zélicourt A，Letousey P，Thoiron S，et al. Ha-DEF1，a sunflower defensin，induces cell death in Orobanche parasitic plants[J]. Planta，2007，226（3）：591-600.endprint

1.2.7重復(fù)性試驗(yàn)精確稱取藥材粉末5份，每份50.0 g，按照“1.2.2”方法，平行制備樣品溶液，各吸取0.4 mL樣品溶液置于5個(gè)20 mL具塞試管中，按“1.2.4”節(jié)方法測(cè)定吸光度。

1.2.8加樣回收試驗(yàn)精確吸取5 份已知含量樣品溶液04 mL，定容于5個(gè)20 mL具塞試管中，分別加入0.55 mg/mL crenatoside對(duì)照品溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mL，按“1.2.4”節(jié)方法顯色測(cè)定吸光度，計(jì)算回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差RSD值。

1.2.9 樣品的測(cè)定 精密吸取3份“1.2.2”節(jié)中樣品溶液各0.4 mL，分別定容于3個(gè)20 mL磨口帶塞試管中，按“1.2.4”節(jié)方法顯色測(cè)定吸光度，重復(fù)測(cè)定3次，取其平均值，向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷含量計(jì)算公式如下：

苯乙醇總苷含量=稀釋倍數(shù)×C×20×10-6×100×100%/m。（1）

式中：C為樣品溶液中苯乙醇總苷的含量；m為向日葵列當(dāng)樣品的干質(zhì)量。

2結(jié)果與分析

2.1不同提取方法的苯乙醇總苷含量

由表1可知，熱回流提取苯乙醇總苷含量明顯高于超聲波提取法、滲濾提取法，因此本研究采用熱回流提取法。與熱回流相比，超聲波提取法、滲濾提取法具有提取時(shí)間短、無(wú)需加熱等優(yōu)點(diǎn)，但向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷提取率不高，這可能與苯乙醇苷類化合物的種類與結(jié)構(gòu)有關(guān)。

3結(jié)論

本研究比較了超聲波提取法、滲濾提取法、熱回流提取法等不同提取方法對(duì)向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷進(jìn)行提取，結(jié)果表明，以熱回流方法為佳，80%乙醇回流法提取效果最好，在5.5～27.5 μg/mL范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，回收率為100.4%，RSD值為2.48%（n=5），向日葵列當(dāng)中苯乙醇總苷平均含量為1.97%。

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[3]江蘇新醫(yī)學(xué)院.中藥大辭典[M]. 上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，1979：8541.

[4]劉曉林，趙秀香，魏穎穎，等. 向日葵列當(dāng)粗提物對(duì)植物病原真菌的抑制作用[J]. 江蘇農(nóng)業(yè)科學(xué)，2008（3）：104-105.

[5]高昂，姚默，崔超，等. 列當(dāng)屬藥學(xué)研究概況[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，2011，39（33）：20394-20395.

[6]趙夢(mèng)霞. 向日葵列當(dāng)化學(xué)成分及其活性研究[D]. 哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2012.

[7]曲正義，侯微，金銀萍，等. 向日葵列當(dāng)抗氧化活性研究[J]. 中藥材，2010，33（11）：1780-1782.

[8]黃長(zhǎng)權(quán). 向日葵列當(dāng)寄生機(jī)理的研究[D]. 哈爾濱：東北農(nóng)業(yè)大學(xué)，2012.

[9]Sauerborn J，Buschmann H，Ghiasi K G，et al. Benzothiadiazole activates resistance in sunflower （Helianthus annuus） to the root-parasitic weed orobanche cuman[J]. Phytopathology，2002，92（1）：59-64.

[10]de Zélicourt A，Letousey P，Thoiron S，et al. Ha-DEF1，a sunflower defensin，induces cell death in Orobanche parasitic plants[J]. Planta，2007，226（3）：591-600.endprint