徐州采煤塌陷區復墾土壤的細菌群落多樣性

摘要：為探討江蘇省徐州市采煤塌陷區土壤微生物群落多樣性及優勢種群在復墾前后的變化，利用454 焦磷酸測序法，對比分析采煤塌陷地、復墾地以及非塌陷對照地這3個樣地的細菌多樣性及群落結構。結果表明，變形菌、放線菌、浮霉菌、酸桿菌、綠彎菌、擬桿菌、厚壁菌和芽單胞菌為細菌的主要類群，但其在3個處理區的分布各不相同，即芽單胞菌和硝化螺旋菌在復墾區中分布最廣，酸桿菌、放線菌、擬桿菌在對照區中最多，變形菌在塌陷區中分布最廣。復墾地土壤的細菌群落多樣性水平最高，對照地次之，塌陷地最低。細菌群落多樣性指數與土壤有機質、全氮、速效鉀的含量呈正相關關系，與土壤鹽分呈負相關關系。開采沉陷導致土壤肥力退化和土壤鹽漬化現象加重，抑制微生物的繁殖與生長。復墾與植被修復能夠改善土壤理化特征，恢復微生物群落結構功能與多樣性。

關鍵詞：采煤塌陷區；復墾土壤；微生物；454 焦磷酸測序法；多樣性

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0312-04

收稿日期：2014-04-09

基金項目：國家自然科學基金（編號：51174207）；江蘇高校優勢學科建設工程項目（編號：SZBF2011-6-B35）。

作者簡介：李媛媛（1985—），女，江蘇徐州人，博士研究生，主要從事礦區土地復墾與土地利用研究。E-mail：cumt_lyy@126.com。采煤會擾動人類活動等，不可避免地會改變土壤生態系統，破壞微生物群落生態功能穩定性。礦區土壤復墾及生態重建已成為全球土壤環境研究領域中的重要課題[1]。土壤微生物群落能敏銳地反映出生態環境的功能演變以及環境脅迫等影響，是衡量礦區土壤生態功能和監測礦區環境變化的有效指示器[2-3]。近年來，我國關于礦區生態恢復的研究取得了豐碩的成果，但主要集中于復墾土壤的物理特性、化學特征和重金屬污染等方面[4-6]。有關復墾土壤的微生物群落特征的研究較少，特別是從分子水平對礦區土壤微生物群落結構及多樣性的報道較為少見。本研究采用定量 PCR 和 454 焦磷酸測序法[7]，通過比較復墾地、塌陷地及對照地的土壤細菌多樣性及群落結構等特征，探討復墾以及植被恢復對土壤微生物群落的影響。一方面為454焦磷酸測序技術的應用提供試驗方法和經驗借鑒，另一方面將認識礦區土壤微生物特性的高度提升到了分子水平，為土壤生態學研究提供了新視角，同時也為礦區生態恢復提供了信息和參考。

1材料與方法

1.1土壤樣品采集與預處理

試驗區設在江蘇省徐州市柳新國家復墾示范項目區內，共包括復墾地、 塌陷地和對照地3個不同處理的采樣區，取具代表性的泥漿泵復墾地以及塌陷未復墾地作為土樣采集對象，并以未受影響的正常農田為對照。復墾區的土壤經泥漿泵復墾后，進行“豆科牧草+禾本科牧草”混播配植，植被包括紫花苜蓿、三葉草以及黑麥草。復墾區與對照區具有相同的種植制度和施肥管理水平。在3個處理區內按照“S”形分別選取5個樣點（重復3次采樣），每個樣點采集0～20 cm深度的土樣，0～20 cm土層四邊各取1/4土樣，混合構成1個樣（按同一處理進行歸類）。各樣區采回的土樣風干過篩后充分混合，過2 mm篩后分裝，保存于4、-80 ℃冰箱中，分別用于理化指標測定和DNA提取。

1.2土壤基本性質測定

按照文獻[8]測定土壤的基本性質，其中有機質含量的測定采用重鉻酸鉀容量法（外加熱法）；pH值的測定采用電導法（水土比 2.5 ∶1）；全氮含量的測定采用半微量開氏法；全磷含量的測定采用 NaOH 熔融-鉬銻抗比色法；速效鉀含量的測定采用 1.0 mol/L NH4Ac 浸提-火焰光度法；土壤鹽分含量使用托普生產的TZS-EC-I電導儀測定。土壤基本理化性質主要參數見表1。

1.3土樣DNA提取、PCR擴增與測序

1.4數據處理與分析

本研究的數據處理與分析采用軟件SPSS 19.0和Excel 2010完成。

2結果與分析

2.116S rRNA基因序列測序結果及細菌群落總體分布特征

454焦磷酸高通量測序共得到31 469條有效序列、26 717 條優化序列。復墾地、塌陷地與對照地分別得到優化序列10 103、10 450、6 164條，平均長度為474 bp。如圖1所示，土壤細菌主要由變形菌 （35.00%）、放線菌 （11.50%）、浮霉菌 （7.24%）、酸桿菌（6.45%）、綠彎菌 （6.02%）、擬桿菌 （464%）、芽單胞菌 （3.79%）、厚壁菌（2.45%）和硝化螺旋菌（2.42%）組成。這些菌群在3個處理區的所有樣品中均有分布，與已有研究結果[9-11]一致。其中，變形菌門占絕對優勢，且在塌陷地中的比例最高（48.23%）。同樣，Tait等在對美國馬薩諸塞州礁湖土壤細菌的研究中發現，72% 的細菌屬于變形菌門[9]；Kolton等在對不同土壤系統的研究中也揭示了變形菌門為最具優勢的土壤細菌類群[10]。這說明變形菌門在維持土壤生態系統功能中扮演著重要的角色，其在土壤中的廣泛分布占據了微生物群落組成的主要部分。變形菌門主要以4種變形菌亞群γ-變形菌、α-變形菌、β-變形菌、δ-變形菌綱為主，其中γ-變形菌占絕對主導地位，為不同環境礦區土壤的廣適類群。與本研究結果不同的是，Roesch 等通過對土壤細菌樣品的測序分析得出，在變形菌門中最具優勢的變形菌亞門為β-變形菌[11]。

2.2土壤細菌群落的多樣性

在不同的相似水平下[97%（0.03）、95%（0.05）、90%（0.10）][11]，通過多樣性指數的非參數分析對比不同處理土壤的物種豐度與多度，結果如表2所示。如表2所示，細菌多樣性水平在不同處理區從大到小依次為復墾地>對照地>塌陷地。復墾地的土壤微生物群落DNA序列的豐富度、均勻度和多樣性指數最高，對照地次之，而未復墾裸地的物種多樣性指數明顯最低。

2.3土壤理化性質與細菌多樣性的相關分析

如表3所示，塌陷地土壤的有機質、全氮、全磷、速效鉀含量均低于對照地，說明開采沉陷造成塌陷區土壤肥力下降，造成其有機質以及氮、磷等土壤養分元素的流失。endprint

摘要：為探討江蘇省徐州市采煤塌陷區土壤微生物群落多樣性及優勢種群在復墾前后的變化，利用454 焦磷酸測序法，對比分析采煤塌陷地、復墾地以及非塌陷對照地這3個樣地的細菌多樣性及群落結構。結果表明，變形菌、放線菌、浮霉菌、酸桿菌、綠彎菌、擬桿菌、厚壁菌和芽單胞菌為細菌的主要類群，但其在3個處理區的分布各不相同，即芽單胞菌和硝化螺旋菌在復墾區中分布最廣，酸桿菌、放線菌、擬桿菌在對照區中最多，變形菌在塌陷區中分布最廣。復墾地土壤的細菌群落多樣性水平最高，對照地次之，塌陷地最低。細菌群落多樣性指數與土壤有機質、全氮、速效鉀的含量呈正相關關系，與土壤鹽分呈負相關關系。開采沉陷導致土壤肥力退化和土壤鹽漬化現象加重，抑制微生物的繁殖與生長。復墾與植被修復能夠改善土壤理化特征，恢復微生物群落結構功能與多樣性。

關鍵詞：采煤塌陷區；復墾土壤；微生物；454 焦磷酸測序法；多樣性

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0312-04

收稿日期：2014-04-09

基金項目：國家自然科學基金（編號：51174207）；江蘇高校優勢學科建設工程項目（編號：SZBF2011-6-B35）。

作者簡介：李媛媛（1985—），女，江蘇徐州人，博士研究生，主要從事礦區土地復墾與土地利用研究。E-mail：cumt_lyy@126.com。采煤會擾動人類活動等，不可避免地會改變土壤生態系統，破壞微生物群落生態功能穩定性。礦區土壤復墾及生態重建已成為全球土壤環境研究領域中的重要課題[1]。土壤微生物群落能敏銳地反映出生態環境的功能演變以及環境脅迫等影響，是衡量礦區土壤生態功能和監測礦區環境變化的有效指示器[2-3]。近年來，我國關于礦區生態恢復的研究取得了豐碩的成果，但主要集中于復墾土壤的物理特性、化學特征和重金屬污染等方面[4-6]。有關復墾土壤的微生物群落特征的研究較少，特別是從分子水平對礦區土壤微生物群落結構及多樣性的報道較為少見。本研究采用定量 PCR 和 454 焦磷酸測序法[7]，通過比較復墾地、塌陷地及對照地的土壤細菌多樣性及群落結構等特征，探討復墾以及植被恢復對土壤微生物群落的影響。一方面為454焦磷酸測序技術的應用提供試驗方法和經驗借鑒，另一方面將認識礦區土壤微生物特性的高度提升到了分子水平，為土壤生態學研究提供了新視角，同時也為礦區生態恢復提供了信息和參考。

1材料與方法

1.1土壤樣品采集與預處理

試驗區設在江蘇省徐州市柳新國家復墾示范項目區內，共包括復墾地、 塌陷地和對照地3個不同處理的采樣區，取具代表性的泥漿泵復墾地以及塌陷未復墾地作為土樣采集對象，并以未受影響的正常農田為對照。復墾區的土壤經泥漿泵復墾后，進行“豆科牧草+禾本科牧草”混播配植，植被包括紫花苜蓿、三葉草以及黑麥草。復墾區與對照區具有相同的種植制度和施肥管理水平。在3個處理區內按照“S”形分別選取5個樣點（重復3次采樣），每個樣點采集0～20 cm深度的土樣，0～20 cm土層四邊各取1/4土樣，混合構成1個樣（按同一處理進行歸類）。各樣區采回的土樣風干過篩后充分混合，過2 mm篩后分裝，保存于4、-80 ℃冰箱中，分別用于理化指標測定和DNA提取。

1.2土壤基本性質測定

按照文獻[8]測定土壤的基本性質，其中有機質含量的測定采用重鉻酸鉀容量法（外加熱法）；pH值的測定采用電導法（水土比 2.5 ∶1）；全氮含量的測定采用半微量開氏法；全磷含量的測定采用 NaOH 熔融-鉬銻抗比色法；速效鉀含量的測定采用 1.0 mol/L NH4Ac 浸提-火焰光度法；土壤鹽分含量使用托普生產的TZS-EC-I電導儀測定。土壤基本理化性質主要參數見表1。

1.3土樣DNA提取、PCR擴增與測序

1.4數據處理與分析

本研究的數據處理與分析采用軟件SPSS 19.0和Excel 2010完成。

2結果與分析

2.116S rRNA基因序列測序結果及細菌群落總體分布特征

454焦磷酸高通量測序共得到31 469條有效序列、26 717 條優化序列。復墾地、塌陷地與對照地分別得到優化序列10 103、10 450、6 164條，平均長度為474 bp。如圖1所示，土壤細菌主要由變形菌 （35.00%）、放線菌 （11.50%）、浮霉菌 （7.24%）、酸桿菌（6.45%）、綠彎菌 （6.02%）、擬桿菌 （464%）、芽單胞菌 （3.79%）、厚壁菌（2.45%）和硝化螺旋菌（2.42%）組成。這些菌群在3個處理區的所有樣品中均有分布，與已有研究結果[9-11]一致。其中，變形菌門占絕對優勢，且在塌陷地中的比例最高（48.23%）。同樣，Tait等在對美國馬薩諸塞州礁湖土壤細菌的研究中發現，72% 的細菌屬于變形菌門[9]；Kolton等在對不同土壤系統的研究中也揭示了變形菌門為最具優勢的土壤細菌類群[10]。這說明變形菌門在維持土壤生態系統功能中扮演著重要的角色，其在土壤中的廣泛分布占據了微生物群落組成的主要部分。變形菌門主要以4種變形菌亞群γ-變形菌、α-變形菌、β-變形菌、δ-變形菌綱為主，其中γ-變形菌占絕對主導地位，為不同環境礦區土壤的廣適類群。與本研究結果不同的是，Roesch 等通過對土壤細菌樣品的測序分析得出，在變形菌門中最具優勢的變形菌亞門為β-變形菌[11]。

2.2土壤細菌群落的多樣性

在不同的相似水平下[97%（0.03）、95%（0.05）、90%（0.10）][11]，通過多樣性指數的非參數分析對比不同處理土壤的物種豐度與多度，結果如表2所示。如表2所示，細菌多樣性水平在不同處理區從大到小依次為復墾地>對照地>塌陷地。復墾地的土壤微生物群落DNA序列的豐富度、均勻度和多樣性指數最高，對照地次之，而未復墾裸地的物種多樣性指數明顯最低。

2.3土壤理化性質與細菌多樣性的相關分析

如表3所示，塌陷地土壤的有機質、全氮、全磷、速效鉀含量均低于對照地，說明開采沉陷造成塌陷區土壤肥力下降，造成其有機質以及氮、磷等土壤養分元素的流失。endprint

摘要：為探討江蘇省徐州市采煤塌陷區土壤微生物群落多樣性及優勢種群在復墾前后的變化，利用454 焦磷酸測序法，對比分析采煤塌陷地、復墾地以及非塌陷對照地這3個樣地的細菌多樣性及群落結構。結果表明，變形菌、放線菌、浮霉菌、酸桿菌、綠彎菌、擬桿菌、厚壁菌和芽單胞菌為細菌的主要類群，但其在3個處理區的分布各不相同，即芽單胞菌和硝化螺旋菌在復墾區中分布最廣，酸桿菌、放線菌、擬桿菌在對照區中最多，變形菌在塌陷區中分布最廣。復墾地土壤的細菌群落多樣性水平最高，對照地次之，塌陷地最低。細菌群落多樣性指數與土壤有機質、全氮、速效鉀的含量呈正相關關系，與土壤鹽分呈負相關關系。開采沉陷導致土壤肥力退化和土壤鹽漬化現象加重，抑制微生物的繁殖與生長。復墾與植被修復能夠改善土壤理化特征，恢復微生物群落結構功能與多樣性。

關鍵詞：采煤塌陷區；復墾土壤；微生物；454 焦磷酸測序法；多樣性

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0312-04

收稿日期：2014-04-09

基金項目：國家自然科學基金（編號：51174207）；江蘇高校優勢學科建設工程項目（編號：SZBF2011-6-B35）。

作者簡介：李媛媛（1985—），女，江蘇徐州人，博士研究生，主要從事礦區土地復墾與土地利用研究。E-mail：cumt_lyy@126.com。采煤會擾動人類活動等，不可避免地會改變土壤生態系統，破壞微生物群落生態功能穩定性。礦區土壤復墾及生態重建已成為全球土壤環境研究領域中的重要課題[1]。土壤微生物群落能敏銳地反映出生態環境的功能演變以及環境脅迫等影響，是衡量礦區土壤生態功能和監測礦區環境變化的有效指示器[2-3]。近年來，我國關于礦區生態恢復的研究取得了豐碩的成果，但主要集中于復墾土壤的物理特性、化學特征和重金屬污染等方面[4-6]。有關復墾土壤的微生物群落特征的研究較少，特別是從分子水平對礦區土壤微生物群落結構及多樣性的報道較為少見。本研究采用定量 PCR 和 454 焦磷酸測序法[7]，通過比較復墾地、塌陷地及對照地的土壤細菌多樣性及群落結構等特征，探討復墾以及植被恢復對土壤微生物群落的影響。一方面為454焦磷酸測序技術的應用提供試驗方法和經驗借鑒，另一方面將認識礦區土壤微生物特性的高度提升到了分子水平，為土壤生態學研究提供了新視角，同時也為礦區生態恢復提供了信息和參考。

1材料與方法

1.1土壤樣品采集與預處理

試驗區設在江蘇省徐州市柳新國家復墾示范項目區內，共包括復墾地、 塌陷地和對照地3個不同處理的采樣區，取具代表性的泥漿泵復墾地以及塌陷未復墾地作為土樣采集對象，并以未受影響的正常農田為對照。復墾區的土壤經泥漿泵復墾后，進行“豆科牧草+禾本科牧草”混播配植，植被包括紫花苜蓿、三葉草以及黑麥草。復墾區與對照區具有相同的種植制度和施肥管理水平。在3個處理區內按照“S”形分別選取5個樣點（重復3次采樣），每個樣點采集0～20 cm深度的土樣，0～20 cm土層四邊各取1/4土樣，混合構成1個樣（按同一處理進行歸類）。各樣區采回的土樣風干過篩后充分混合，過2 mm篩后分裝，保存于4、-80 ℃冰箱中，分別用于理化指標測定和DNA提取。

1.2土壤基本性質測定

按照文獻[8]測定土壤的基本性質，其中有機質含量的測定采用重鉻酸鉀容量法（外加熱法）；pH值的測定采用電導法（水土比 2.5 ∶1）；全氮含量的測定采用半微量開氏法；全磷含量的測定采用 NaOH 熔融-鉬銻抗比色法；速效鉀含量的測定采用 1.0 mol/L NH4Ac 浸提-火焰光度法；土壤鹽分含量使用托普生產的TZS-EC-I電導儀測定。土壤基本理化性質主要參數見表1。

1.3土樣DNA提取、PCR擴增與測序

1.4數據處理與分析

本研究的數據處理與分析采用軟件SPSS 19.0和Excel 2010完成。

2結果與分析

2.116S rRNA基因序列測序結果及細菌群落總體分布特征

454焦磷酸高通量測序共得到31 469條有效序列、26 717 條優化序列。復墾地、塌陷地與對照地分別得到優化序列10 103、10 450、6 164條，平均長度為474 bp。如圖1所示，土壤細菌主要由變形菌 （35.00%）、放線菌 （11.50%）、浮霉菌 （7.24%）、酸桿菌（6.45%）、綠彎菌 （6.02%）、擬桿菌 （464%）、芽單胞菌 （3.79%）、厚壁菌（2.45%）和硝化螺旋菌（2.42%）組成。這些菌群在3個處理區的所有樣品中均有分布，與已有研究結果[9-11]一致。其中，變形菌門占絕對優勢，且在塌陷地中的比例最高（48.23%）。同樣，Tait等在對美國馬薩諸塞州礁湖土壤細菌的研究中發現，72% 的細菌屬于變形菌門[9]；Kolton等在對不同土壤系統的研究中也揭示了變形菌門為最具優勢的土壤細菌類群[10]。這說明變形菌門在維持土壤生態系統功能中扮演著重要的角色，其在土壤中的廣泛分布占據了微生物群落組成的主要部分。變形菌門主要以4種變形菌亞群γ-變形菌、α-變形菌、β-變形菌、δ-變形菌綱為主，其中γ-變形菌占絕對主導地位，為不同環境礦區土壤的廣適類群。與本研究結果不同的是，Roesch 等通過對土壤細菌樣品的測序分析得出，在變形菌門中最具優勢的變形菌亞門為β-變形菌[11]。

2.2土壤細菌群落的多樣性

在不同的相似水平下[97%（0.03）、95%（0.05）、90%（0.10）][11]，通過多樣性指數的非參數分析對比不同處理土壤的物種豐度與多度，結果如表2所示。如表2所示，細菌多樣性水平在不同處理區從大到小依次為復墾地>對照地>塌陷地。復墾地的土壤微生物群落DNA序列的豐富度、均勻度和多樣性指數最高，對照地次之，而未復墾裸地的物種多樣性指數明顯最低。

2.3土壤理化性質與細菌多樣性的相關分析

如表3所示，塌陷地土壤的有機質、全氮、全磷、速效鉀含量均低于對照地，說明開采沉陷造成塌陷區土壤肥力下降，造成其有機質以及氮、磷等土壤養分元素的流失。endprint