1株產纖維素酶絲狀真菌產油工藝的優化

摘要：以1株峽串脈孢霉為材料，利用玉米秸稈纖維素為主要碳源，以產油率為指標，通過單因素及正交試驗方法優化產油發酵工藝，發現最優產脂發酵工藝為：碳源為2%纖維素+2%葡萄糖，氮源為硝酸銨，溫度為28 ℃，培養時間為5 d，初始pH值為4，C/N比為8 ∶1。氮源選擇具有統計學上的顯著性，所做交互作用不明顯。

關鍵詞：絲狀真菌；產油工藝；正交試驗；纖維素酶；峽串脈孢霉

中圖分類號： Q939.9文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0316-02

收稿日期：2013-10-13

基金項目：忻州師范學院科研項目（編號：201005）。

作者簡介：張玲秀（1975—），男，山西定襄人，碩士，助教，主要從事資源微生物和應用微生物研究。E-mail：twozeroxiu@126.com。纖維素類物質是地球上分布最廣、含量最豐富的碳源物質，是自然界中數量最大的可再生資源，纖維素的轉化利用對于解決目前世界能源危機、糧食短缺、環境污染等問題，具有十分重要的意義。通過菌種選育和發酵工藝等基礎研究，分離和篩選出針對不同行業的高效纖維素分解菌群，有望解決纖維素酶產量和活性都不高、成本偏高的問題[1]。最近，石油價格波動和國家能源安全的需求，促使全球發展可持續生物工藝替代傳統的石油加工，通過微生物代謝，生產下一代生物燃料，包括游離脂肪酸、長鏈脂肪醇和酯類、長鏈烯烴等。工程菌株可利用糖類來生產生物燃料，通過傳統的工藝優化進一步提高產量[2]。試驗所使用的絲狀真菌，不僅可高產纖維素酶（45.32 U），而且菌體可積累14.24%的油脂，具有一定的應用價值和進一步研究的必要性[3]。本試驗對該真菌產纖維素酶和胞內產油脂的工藝進行優化，旨在篩選高效降解纖維素和產油脂菌株的基礎上，建立一種利用農業秸稈生產微生物油脂的工藝。

1材料與方法

1.1試驗材料

1.1.1試驗菌株所用菌株為忻州師范學院篩選獲得的1株峽串脈孢霉（Paepalopsis Kühn），該菌株的纖維素酶活和濾紙酶活均高于里氏木霉（Trichoderma reesei）[3]。

1.1.2培養基產脂發酵培養基：玉米秸稈纖維素（CMC）2%，酵母膏0.3%，檸檬酸三鈉0.1%，硝酸鈉0.3%，K2HPO4 0.1%，KCl 0.05%，FeSO4·7H2O 0.015%，CaCl2、CuSO4、ZnSO4 均為0.004%，1×105 Pa滅菌30 min。

1.1.3主要儀器UV2550紫外可見光譜（日本島津）；SY-305B 發酵罐，由上海世遠生物設備工程有限公司生產；YXQ-LS-50G 立式壓力蒸汽滅菌器，由上海博迅實驗有限公司醫療設備廠生產；天平，由梅特勒托利多儀器有限公司生產；THZ-98A恒溫振蕩器，由上海一恒科學儀器有限公司生產；旋轉蒸發儀，由上海亞榮生化儀器廠生產。

1.2試驗方法

1.2.1油脂含量的測定菌種在PDA培養基試管斜面上 27 ℃ 培養活化3次后轉接到產脂發酵培養基中，再經5 d振蕩培養，收集菌體，用水充分洗滌后80 ℃烘干，稱質量。干菌體用氯仿-甲醇（體積比2 ∶1）混合溶劑在索氏抽提器中 80 ℃ 回流6 h，用旋轉蒸發儀減壓，去除溶劑得粗油脂，再用石油醚充分溶解粗油脂后，過濾去除雜質，減壓蒸餾去除石油醚即得油脂，稱質量。油脂質量與干菌體質量之比即為產油率[4]。

1.2.2單因素及正交優化設計本試驗單因素優化選取6個因素：纖維素濃度、氮源、培養溫度、培養時間、初始pH值、C/N，以含油率為指標，得到各因素最適水平。在單因素試驗的基礎上進一步做L27（313）正交優化試驗（表1、表2）。

2結果與分析

2.1單因素試驗結果

2.1.1碳源對產油率的影響通過改變產脂發酵培養基中纖維素濃度和葡萄糖（Glu）的添加量，進行最適碳源濃度的篩選。由圖1可知，隨著纖維素濃度升高，產油率不斷提高，當增加到一定濃度時則產油率不再提高，2%纖維素+2%葡萄糖（Glu）為最適碳源，產油率為14.48%，這可能是因為碳源達到飽和后，將不再影響產油率。另外，一定量的葡萄糖將有助于提高產油率，這是因為葡萄糖作為可高效利用的碳源，有利于菌體的快速生長。

2.1.2氮源對產油率的影響以2%纖維素+2%的葡萄糖為碳源，分別選取酵母膏、蛋白胨、硫酸銨、硝酸鈉、硝酸銨為氮源，對最適氮源進行篩選。由圖2可知，硝酸銨為最適氮源，產油率為30%，這可能與菌體積累油脂是在氮缺乏下進行有關，與Gill等的研究結果[5]一致。

2.1.3培養溫度對產油率的影響分別采用20、24、28、32、36 ℃等不同培養溫度進行培養，結果（圖3）表明，28 ℃ 為最佳培養溫度，產油率為25.32%，這與絲狀真菌菌體最佳生長溫度相匹配。

2.1.4培養時間對產油率的影響由圖4可見，菌種 1～7 d

不斷培養過程中，產油率不斷變化；培養5 d產油率最高，達25.41%，為最適培養時間。這是因為菌體在不斷生長過程中，隨著外界培養條件的惡化，積累油脂量逐漸達到最大值。

2.1.5培養基初始pH值對產油率的影響分別配制初始pH值為2、4、6、8、10的液體培養基，碳源為2%纖維素+2%葡萄糖，氮源為硝酸銨，于28 ℃連續培養5 d后，離心沉淀菌絲體并提取油脂計算產油率。由圖5可見，在酸性培養條件下產油率較高，其中初始pH值為4時產油率最高，為24.46%。

2.1.6C/N比對產油率的影響以2%纖維素+2%葡萄糖作為碳源，液體培養基中加入C/N比為2 ∶1、4 ∶1、8 ∶1、12 ∶1、16 ∶1的硝酸銨溶液。由圖6可見，C/N比為8 ∶1時產油率最高，可達18.41%。endprint

2.2正交試驗結果

正交試驗結果見表2。用SPSS Statistics 20軟件分析各因素顯著性及交互作用，結果見表3。由表3可見，各因素對產油率影響大小依次為氮源>纖維素濃度>初始pH值>C/N比>培養溫度。其中，氮源在統計學上顯著（P<0.05），纖維素濃度在α=0.1水平上顯著，所做3項交互作用不顯著。

3小結

本試驗以高產纖維素酶的1株絲狀產油真菌為材料，利用農業玉米秸稈纖維素為主要碳源，通過單因素及正交試驗方法優化產油發酵工藝，發現最優產油發酵工藝為：碳源為2%纖維素+2%葡萄糖，氮源為硝酸銨，溫度為28 ℃，培養時間為5 d，初始pH值為4，C/N比為8 ∶1，這為進一步開發和利用農業秸稈、生產微生物油脂提供了參考，具有一定的理論研究意義和實際應用價值。

參考文獻：

[1]張傳富，顧文杰，彭科峰，等. 微生物纖維素酶的研究現狀[J]. 生物信息學，2007，5（1）：34-36.

[2]Perlack R D，Wright L L，Turhollow A F，et al.Biomass as feedstock for a bioenergy and bioproducts industry：the technical feasibility of a billionton annual supply[D]. USDA：Oak Ridge National Laboratory，2005.

[3]張玲秀，溫雪梅，鄭小妹，等. 降解玉米秸稈纖維素真菌的篩選及產油特性的研究[J]. 安徽農學通報，2012，18（17）：47-49.

[4]劉吉華，袁生，戴傳超. 一種新的絲狀真菌油脂含量快速鑒定方法[J]. 生物技術，1998，8（1）：43-44，40.

[5]Gill C O，Hall M J，Ratledge C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast（Candida 107）growing on glucose in single-stage continuous culture[J]. Applied and Environmental Microbiology，1977，33（2）：231-239.馬曉麗，張婷婷，郭歡，等. 紅花根際磷細菌篩選、鑒定及其促生效果[J]. 江蘇農業科學，2014，42（9）：318-322.endprint

2.2正交試驗結果

正交試驗結果見表2。用SPSS Statistics 20軟件分析各因素顯著性及交互作用，結果見表3。由表3可見，各因素對產油率影響大小依次為氮源>纖維素濃度>初始pH值>C/N比>培養溫度。其中，氮源在統計學上顯著（P<0.05），纖維素濃度在α=0.1水平上顯著，所做3項交互作用不顯著。

3小結

本試驗以高產纖維素酶的1株絲狀產油真菌為材料，利用農業玉米秸稈纖維素為主要碳源，通過單因素及正交試驗方法優化產油發酵工藝，發現最優產油發酵工藝為：碳源為2%纖維素+2%葡萄糖，氮源為硝酸銨，溫度為28 ℃，培養時間為5 d，初始pH值為4，C/N比為8 ∶1，這為進一步開發和利用農業秸稈、生產微生物油脂提供了參考，具有一定的理論研究意義和實際應用價值。

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[4]劉吉華，袁生，戴傳超. 一種新的絲狀真菌油脂含量快速鑒定方法[J]. 生物技術，1998，8（1）：43-44，40.

[5]Gill C O，Hall M J，Ratledge C. Lipid accumulation in an oleaginous yeast（Candida 107）growing on glucose in single-stage continuous culture[J]. Applied and Environmental Microbiology，1977，33（2）：231-239.馬曉麗，張婷婷，郭歡，等. 紅花根際磷細菌篩選、鑒定及其促生效果[J]. 江蘇農業科學，2014，42（9）：318-322.endprint

2.2正交試驗結果

正交試驗結果見表2。用SPSS Statistics 20軟件分析各因素顯著性及交互作用，結果見表3。由表3可見，各因素對產油率影響大小依次為氮源>纖維素濃度>初始pH值>C/N比>培養溫度。其中，氮源在統計學上顯著（P<0.05），纖維素濃度在α=0.1水平上顯著，所做3項交互作用不顯著。

3小結

本試驗以高產纖維素酶的1株絲狀產油真菌為材料，利用農業玉米秸稈纖維素為主要碳源，通過單因素及正交試驗方法優化產油發酵工藝，發現最優產油發酵工藝為：碳源為2%纖維素+2%葡萄糖，氮源為硝酸銨，溫度為28 ℃，培養時間為5 d，初始pH值為4，C/N比為8 ∶1，這為進一步開發和利用農業秸稈、生產微生物油脂提供了參考，具有一定的理論研究意義和實際應用價值。

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