紅花根際磷細菌篩選、鑒定及其促生效果

馬曉麗等

摘要：通過選擇培養基，從紅花根際土中分離出8株溶磷效果好的解磷細菌。鉬銻抗比色法測量其溶磷能力，通過形態學、生理生化表型測定，結合16S rDNA基因序列同源性分析鑒定，并對獲得的溶磷效果較好的菌株進行盆栽試驗。試驗結果表明：8株菌分為以下幾個屬，CM1 和 CM6屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），CM4、CM7、CM8屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），CM2、CM3、CM5分別屬于根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、不動桿菌屬（Acinetobacter）。CM5、CM6兩株菌對紅花生長有明顯的促進作用。

關鍵詞：紅花；溶磷細菌；篩選和鑒定；促生

中圖分類號： S154.3文獻標志碼： A文章編號：1002-1302（2014）09-0318-05

通信作者：張霞，教授，碩士生導師，從事植物遺傳研究。E-mail：xiazh@shzu.edu.cn。磷是植物生長發育所必需的營養元素[1]，缺磷可導致農作物產量明顯降低。土壤全磷含量雖然較高，但易與土壤中的金屬離子相結合形成難溶的磷化物，只有少量磷肥可以被植物吸收利用。當季的作物對施入磷肥的利用率僅為25%，因此，磷被認為是限制性營養元素[2]。紅花生長發育受化學肥料尤其是磷酸鹽肥料影響較大，但使用這些化學肥料會增加土壤及水污染，過量使用磷肥會造成水體富營養化[3]，同時會積累一些重金屬，威脅人類的健康。另一方面，長期使用化學肥料會導致土壤結構退化[4]。如今，基于化學肥料價格及對農業系統可持續發展的考慮，人們對生物肥料的關注越來越高。

一些細菌可以提供植物生長所需的磷，同時扮演了溶磷微生物的角色。土壤中存在大量有溶磷能力的微生物，稱為溶磷微生物[5]。溶磷微生物能將難以被植物吸收的磷元素轉化為易于吸收利用的狀態，提高磷元素的利用率，從而提高作物產量，也減少了磷肥的過度使用。利用溶磷微生物將難溶性磷酸鹽轉變為可溶性磷是非常有必要的。溶磷微生物提高有效磷含量的同時，還可改善施用化學磷肥所帶來的環境污染。因此研究根際磷細菌，對發展溶磷微生物肥料具有重要的現實意義。目前已有的溶磷微生物種類很多，有細菌、真菌、放線菌等，溶磷能力差異較大[6]。所以，從根際土中篩選出溶磷能力好的溶磷微生物，制成生物肥料來提高磷素利用率成為研究熱點。

本研究從紅花根際土中篩選出8株溶磷細菌，并對8株溶磷細菌進行了鑒定，同時在溫室條件下，選取3株溶磷效果較好并且具有良好溶磷穩定性的解磷菌接種紅花，研究了3株解磷菌對紅花盛花期生長的影響。該研究以期為紅花生物肥料菌種資源與應用提供一定的理論依據。

1材料與方法

1.1材料

供試植物：紅花（Carthamus tinctorius L.）種子，品種“新紅4號”，產地新疆石河子。

供試培養基：蒙金娜無機培養基：葡萄糖 10 g，瓊脂20 g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03 g，MgSO4·4H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，磷礦粉 10 g，酵母膏0.4 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.5；蒙金娜無機液體培養基：配方同蒙金娜無機培養基，不加瓊脂。

蒙金娜有機培養基：葡萄糖 10g，瓊脂20g，（NH4）2SO4 0.5 g，NaCl 0.3 g，KCl 0.3 g，FeSO4·7H2O 0.03g，MgSO4·4H2O 0.03 g，MgSO4·7H2O 0.3 g，卵磷脂0.2 g，碳酸鈣 5 g，酵母膏0.4 g，蒸餾水1 000 mL，pH值7.0～7.5；蒙金娜有機液體培養基：配方同蒙金娜有機培養基，不加瓊脂。

溶磷細菌純培養保藏培養基（NA）：牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，瓊脂20 g，水1 000 mL，pH值7.0～7.2；溶磷細菌培養培養基（NB）：配方同NA，不添加瓊脂。

1.2方法

1.2.1紅花室內培育選取粒大、飽滿、色白的紅花種子，在40 ℃溫水中浸泡10 min，轉入冷水中冷卻，取出晾干后播種。每盆播20粒紅花種子，室溫15 ～20 ℃下培養至發芽。

1.2.2紅花大田定植移栽紅花幼苗之前，對移栽地進行精耕細耙，以減少樣地空間異質性。待紅花幼苗生長30 d后，選擇生長狀況相對一致的幼苗移栽至試驗大田中。大田設在石河子大學節水灌溉試驗站（兵團灌溉試驗站石河子大學分站）（北緯40°16′58.4″～46°43′31.8″，東經82°30′32″～89°01′02″）。此區域屬典型大陸性干旱半干旱氣候，樣地具體概況見表1。

1.2.3土壤樣品的采集紅花伸長期從樣地里挖出整株紅花，抖掉根周圍松散的土壤，刷下附著在紅花根上的土壤，裝入封口袋密封后帶回實驗室，過1 mm篩后，放入4 ℃冰箱保存備用。

1.2.4紅花根際溶磷細菌分離純化及篩選稱取5 g保存的土壤樣品，加入45 mL無菌水與10粒滅菌玻璃珠，常溫200 r/min振蕩25 min，按10倍稀釋法稀釋樣品。采用10-4、10-5、10-6稀釋濃度，使用蒙金娜固體培養基培養。30 ℃恒溫培養5 d。測量解磷圈直徑（D）、菌落直徑（d），根據D/d大小來初步確定菌株的解磷能力。挑取單菌落至NA培養基培養2～3 d，置于4 ℃冰箱保存。解磷細菌的復篩采用鉬銻抗比色法[7]。通過初篩，選擇8株溶磷圈較大的菌株，分別接種于30 mL NB培養基中，120 r/min、28 ℃培養36 h，并用無菌水制成108 CFU/mL懸浮菌液。每瓶接種1 mL細菌菌液于滅菌的蒙金娜液體搖瓶培養基中，重復3次。以接種等量滅活細菌液作對照，搖床培養（28 ℃，160 r/min）5 d。鉬銻抗比色法測定上清液有效磷含量及測定上清液pH值。endprint

1.2.5溶磷細菌的鑒定

1.2.5.1理化性質及形態學分類按照文獻[8]作形態與生理生化分析。

1.2.5.216S rDNA鑒定使用細菌16S rDNA的通用引物8F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′）和1492R（5′-CGGTTACCTTGTTACGACTT-3′）進行擴增。PCR擴增經瓊脂糖凝膠電泳檢測產物后，送至北京三博遠志測序部測序。將得到的序列提交到GenBank數據庫，利用BLAST與GenBank數據庫中的序列進行比對，用ClustalX1.81軟件將相近序列進行多重序列分析，利用MEGA V.4.0軟件構建系統發育樹（Bootstrap=1 000）。

1.2.6溶磷細菌的溫室試驗將3株溶磷效果好的溶磷菌活化，接種于液體培養基中，28 ℃、200 r/min振蕩培養2 d后，發酵液離心（4 ℃，4 000 r） 5 min，無菌生理鹽水洗菌體3次，用無菌生理鹽水制成108 CFU/mL懸浮菌液，接種紅花幼苗（苗齡20 d），每株接種量8 mL，以接種生理鹽水作對照，每個處理3個重復，溫室培養，培養基質為土壤 ∶蛭石 ∶沙子=3 ∶1 ∶1的混合基質，每盆4 kg，土壤有機質為9.8 g/kg，速效磷為6.5 mg/kg，速效鉀為155 mg/kg，堿解氮為35.9 mg/kg。紅花接種90 d后測株高、莖粗、葉片數、根長、莖干質量。

2結果與分析

2.1紅花根際磷細菌的分離與篩選

用選擇培養基平板從紅花根際土中分離出10株能產生溶磷圈的細菌。利用解磷圈直徑（D）、菌落生長直徑（d）的比值作為解磷菌相對解磷能力的指標，10個菌株D/d值在1.87～4.03，D/d>4的有1株，2

2.2溶磷細菌溶磷能力測定

測定結果見表3。不同菌株的溶磷量在181.34～283.14 mg/L之間，顯著高于對照（P<0.05），說明8株菌株都有較強的溶磷能力。其中CM6的總解磷量為283.14 mg/L，顯著高于其他菌株，解磷效果最強。CM4的總解磷量最低，為181.34 mg/L。

2.3溶磷細菌的鑒定

2.3.1溶磷細菌的形態學特征對8株溶磷細菌的形態及菌落特征觀察，可以得到，菌株CM4、CM7、CM8為芽孢革蘭形，表面光滑，濕潤，邊緣整齊，除CM5無鞭毛外，CM1、CM2、CM6均有極生鞭毛；CM3為革蘭氏陽性菌，菌落灰白色，不規則形，干燥，不透明，不易挑取，結果見表4。

2.3.2溶磷細菌的生理生化特性對8株溶磷細菌的生理生化鑒定有氧化酶、接觸酶、淀粉水解、吲哚試驗、甲基紅測試等，結果見表5。8株菌在接觸媒試驗中均表現為陽性，而在氧化酶反應、淀粉酶試驗及吲哚試驗中，陰性與陽性各占50%，甲基紅試驗中，陽性為12.5%。其中，CM1、CM6淀粉水解及甲基紅反應為陰性，其余均為陽性；CM4、CM7、CM8甲基紅反應、氧化酶反應為陰性，其余均為陽性；CM2淀粉水解、甲基紅反應及吲哚反應為陰性，其余為陽性；CM3全為陽性、CM5接觸酶反應及需氧反應為陽性，其余均為陰性。

2.3.316SrDNA 鑒定分別以8個菌株DNA為模板，采用表58株溶磷細菌生理生化特性

試驗名稱CM1CM2CM3CM4CM5CM6CM7CM8需氧反應++++++++氧化酶試驗+++--+--過氧化氫酶試驗++++++++淀粉酶試驗--++--++甲基紅試驗--+-----吲哚試驗+-++-+--注：“-”為陰性反應；“+”為陽性反應。

通用引物擴增出長約1 500 bp的片段，瓊脂糖凝膠電泳檢測后進行測序。將8株菌16S rDNA基因序列提交到GenBank數據庫，其登錄號分別為KC844218、KC844219、KC844220、KC844221、KC844222、KC844223、KC844224、KC844225，通過Blast工具在GenBank數據庫中與已發表的16S rDNA基因序列進行同源性比對，與相近序列聯配比較構建系統發育樹。由系統發育樹（圖1）可知，8株菌隸屬于假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter），分別與已知種熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）、地衣芽孢桿菌（Bacillus licheniformis）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti）、乙酸鈣不動桿菌（Acinetobacter calcoaceticus）、銅綠色假單胞菌（Pseudomonas）、芽孢桿菌（Bacillus sp.）系統發育關系接近，序列同源性分別達到99%。再結合細菌的培養特征、生理生化測定結果和系統發育分析結果，初步確定8株菌中：CM1 和 CM6屬于假單胞菌屬（Pseudomonas），CM4、CM7、CM8屬于芽孢桿菌屬（Bacillus），CM2、CM3、CM5分別屬于根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、不動桿菌屬（Acinetobacter）。菌株CM1、CM2、CM3、CM4、CM5、CM6、CM7、CM8分別鑒定為Pseudomonas sp.、Sinorhizobium meliloti、Streptomyces、Bacillus licheniformis、Acinetobacter calcoaceticus、Pseudomonas fluorescens、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus mojavensis。

2.4解磷菌菌株對紅花的促生長作用

在溫室條件下，將紅花分別接種CM1、CM5、CM6，90 d后測株高、莖粗、葉片數、根長、莖干質量。結果如表6所示，接種3株溶磷菌后，紅花的株高、莖粗、葉片數、根長、莖干質量，菌處理的各項指標均超過未處理的對照，除CM1外，接種CM5、CM6各項指標顯著提高（P<0.05），說明除CM1外，其余兩株溶磷細菌對紅花生長具有促進作用。

3討論

從紅花根際土壤中分離出8株具有較好解磷效果的溶磷細菌，分別為CM1、CM2、CM3、CM4、CM5、CM6、CM7、CM8。經生理生化及16S rDNA 鑒定后，分為以下幾個屬：假單胞菌屬（Pseudomonas）、根瘤菌屬（Bradyrhizobium）、鏈霉菌屬（Streptomyces）、芽孢桿菌屬（Bacillus）、不動桿菌屬（Acinetobacter），菌株CM1、CM2、CM3、CM4、CM5、CM6、CM7、CM8分別鑒定為Pseudomonas sp.、Sinorhizobium meliloti、Streptomyces、Bacillus licheniformis、Acinetobacter calcoaceticus、Pseudomonas fluorescens、Bacillus amyloliquefaciens、Bacillus mojavensis。

接種3株具有穩定遺傳能力的溶磷細菌CM1、CM5、CM6后，CM5、CM6菌株顯著增加了紅花植株株高、莖粗、葉片數、根長、莖干重，說明這2株溶磷細菌能夠促進紅花對營養物質的吸收。這3株菌被定義為促進植物生長的根際細菌[10]，能夠促進植物生長，有效阻止病原菌侵染植物。有研究結果表明，接種溶磷微生物后，成功地減少了植物染病的概率[11-12]。

多數研究者認為，微生物的解磷作用，主要取決于其分泌有機酸的能力以及它們的螯合能力[13]。Fankem等發現解磷微生物解磷能力隨著土壤pH值降低而升高，與分泌的有機酸產物相關[14]。Hinsinger發現根部釋放的有機配體也能夠改變土壤中有效磷的濃度[15]。相關研究發現熒光假單胞菌分泌葡萄糖酸和草酸；芽孢桿菌屬分泌檸檬酸和葡萄糖酸，解淀粉芽孢桿菌及地衣芽孢桿菌分別分泌乳酸和異戊酸[16]。本試驗中，pH值與對照相比較有所降低，說明8株菌產生相應的酸，但解磷能力與分泌有機酸這兩者之間是否有必然的聯系，需要進一步研究。

解磷微生物優勢之一是其繁殖速率，能夠滿足植物根際對磷的需求。印度農業研究所研究溶磷菌對小麥和水稻產量及磷吸收影響的研究結果表明：接種溶磷菌使其產量及對磷的吸收均有所增加[17]。Ratti等研究表明，檸檬草接種溶磷微生物后，與對照相比，其高度及生物量都顯著升高[18]。Hazarika等指出，使用溶磷微生物肥料顯著增加了茶樹植株高度[19]。Mustafa等研究發現，接種磷細菌對其他植物也存在促進效果[20]。Belimov等的研究結果表明，土壤接種混合微生物后，植物根部對磷素及氮素的吸收明顯升高[21]。生物肥料的施用對農業生產及保護環境具有重大意義。本試驗以紅花根際土為研究對象，從紅花根際土中分離、篩選及鑒定出8株溶磷能力好的解磷細菌。選取3株溶磷效果較好并且具有穩定遺傳能力的溶磷細菌接種紅花，其中兩株菌能夠促進紅花生長。本研究為紅花生物肥料菌種資源提供一定的理論基礎，對紅花微生物肥料研究具有一定意義。后期將會重點研究紅花菌根真菌接種后對紅花根際磷細菌的影響，以期了解菌根真菌、解磷細菌及植物營養三者之間的關系，為微生物肥料的研究提供理論依據。

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