中國楊樹多倍體誘導研究現狀

費希同　唐軍榮　周軍　林源　巨苗苗　辛培堯

摘要：楊樹具有分布廣、適應性強、生長迅速等特點，是造林綠化的重要樹種。楊樹多倍體誘導已成為近年來楊樹育種的熱點，培育出的良種具有生長快、抗性強和品質優的特點。該育種方法為林木育種提供了更為廣闊的發展空間。對近年來楊樹多倍體的誘導、鑒定等方面進行了概述，并對存在的問題提出了解決的建議，以期為楊樹多倍體育種提供理論參考。

關鍵詞：楊樹；多倍體；誘導；研究現狀

中圖分類號：S792.11；S722.3+5 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4252-05

多倍體是指生物體細胞中含有兩套以上的基因組，是生物進化的重要形式。在被子植物中，多倍體出現的頻率在30%～35%，而目前認為在進化過程中70%以上的種類均經歷過多倍化，這一過程為自然界提供了豐富的基因資源[1]。自然界中尤其是在植物界，存在著大量的多倍體，其中許多都表現出優良的性狀。楊樹是世界上最普遍的樹種之一，具有分布廣、適應性強、生長迅速等特點，將多倍體誘導技術與楊樹育種相結合，有望培育出優良的楊樹品種。

楊樹多倍體植株在生長速度、品質以及代謝物方面具有很強的優勢[2]。其表型通常在一些性狀上優于二倍體[3]。具體表現在巨大性、抗性和一些生理結構的變化，例如生長量增加、抗寒、抗旱、抗病蟲害、器官大小、成分含量等[4]。培育出的三倍體歐洲山楊抗干旱和瘠薄性能較其親本二倍體有明顯的優勢，并且還有較強的抗病蟲害的能力[5]。楊樹的多倍體具有較高的經濟、生態和社會價值，并具有巨大的開發潛力[6-8]。例如歐洲山楊（Populus tremula）×美洲山楊（Populus tremuloides）雜交培育的三倍體植株的材積是山楊的100%～200%，纖維長度增加近20%[9]。毛白楊（Populus tomentosa）在自然條件下發現其三倍體植株，倍性優勢顯著，遺傳改良效果明顯高于二倍體，與毛白楊的二倍體相比木材產量可增加100%以上，纖維長度提高近30%，出漿率是同種二倍體的200%，并且是高檔新聞紙和膠印紙的上等材料，是目前解決造紙原料的最佳品種[7，9-11]。實踐證明，楊樹的三倍體植株不僅在材積上優于二倍體，而且在木材理學方面也有良好的表現，并且遺傳性狀較好，具有重要的研究價值和開發價值[7，12]。

楊樹多倍體育種研究主要集中在兩方面，一方面是選育速生、高產、抗性強等優良品種；另一方面是提高多倍體誘導的效率。木本植物物種的豐富性以及無性繁殖等特點，極大地發揮了多倍體育種的優勢[13]。對楊樹多倍體育種過程中誘導途徑、鑒定方法以及育種現狀進行概述，并就目前存在的問題提出建議，以期對楊樹多倍體育種研究提供一定的理論參考。

1 楊樹多倍體誘導方法

1.1 化學誘導法

化學誘導法是利用化學誘變劑對植物染色體進行加倍的一類手段。此類方法的原理為，施加化學物質作用于植物微管蛋白上，致使細胞分裂形成紡錘絲的過程受到抑制，導致染色體不能移向兩級，使細胞停留在細胞分裂中期，從而形成染色體加倍[12]。化學誘導法對分裂活躍的器官、組織或細胞的誘導效果明顯，所以在選擇該方法的同時，應注意試驗材料的選取，原則上應選取莖尖、根尖、萌動的種子、愈傷組織等分裂細胞較多的材料。目前使用的化學誘導劑有戊炔草胺、氟樂靈、安磺靈、秋水仙素等[14]，而秋水仙素被認為是最為有效的誘導劑[15-20]。

1.1.1 注射法 使用注射器直接將秋水仙素等藥劑注射到待處理部位，此方法適用于楊樹2n花粉和2n大孢子的誘導[13]。有學者利用注射法探索四種抗微管物質對白楊的誘導效果，結果發現用200μmol/L戊炔草胺注射花芽效果最好，2n花粉誘導率為84.4%，且最為經濟。該方法快速高效，藥劑投放準確，但在實施過程中，由于注射藥劑量有限，有時不能達到所需劑量，而且在注射過程中會造成組織的損傷，往往會影響誘導效果。

1.1.2 浸泡法 即用一定濃度的秋水仙素或其他誘導劑，將待誘導材料直接浸泡在藥液中。此方法適用于楊樹合子和胚囊體的染色體加倍[13]。具有操作簡便，推廣性強，適用材料廣的優點。研究表明，以哲引3號楊為母本，以小青楊和北京楊為父本，授粉后用秋水仙素浸泡雌花序，得到青楊雜種三倍體[20]。Einspahr[21]將美洲山楊受精后的花序浸泡在0.3%的秋水仙素溶液中6 h，成功獲得四倍體植株，并創造性地解決了誘導楊樹多倍體中產生嵌合體的問題。這些研究均證明了授粉后采用秋水仙素處理是一種高效可行的三倍體誘導方案。

1.1.3 涂抹法 將配制好的誘導藥劑涂抹于材料表面。適用于楊樹幼苗莖尖染色體加倍[12]。國內研究者采用秋水仙素處理美洲黑楊（P. deltoides）與小葉楊（P. simonii）雜交產生子一代并作為多倍體誘導的材料，先用鑷子將苗木頂端的小葉去掉，再用脫脂棉將生長點包裹住，最后將秋水仙素滴加在脫脂棉上。結果證明，誘導產生的四倍體植株在葉綠素含量和株高等方面均優于父母本[22]。該方法操作簡便，藥劑用量少，不需損傷植物體且可以對生長中的楊樹進行誘導，便于恢復，試驗周期短。

1.1.4 混培法[16] 該法是將待處理材料接種在附加有誘導劑的組織培養基上培養。利用這種方法較適用于楊樹的幼葉、愈傷組織、嫩莖以及葉柄等材料[12，20，23-25]。西南林業大學以滇楊葉柄為外植體，先在分化培養基中預培養5 d，繼而在附加有40 mg/L秋水仙素的分化培養基中誘導處理2 d，其誘導變異率可達51%[24]。此外，劉巖[23]將滇楊葉柄在附加有80～90 mg/L秋水仙素的分化培養基上培養30 d時，多倍化性狀明顯，誘導率可達16.18%。此方法誘導效果較好，可有效地減少嵌合體，試驗條件易于控制且重復性強，在多倍體育種中有廣泛的應用。

1.2 物理誘導

物理誘導一般采用溫度、機械損傷、γ射線等物理因素來誘使染色體加倍。石樂等[26]以毛新楊（Populus tomentosa × P. bolleana）×新疆楊（Populus alba var. pyramidalis Bunge）雜交，同時進行39℃高溫處理，四倍體誘導率最高可達7.4%，并獲得一定數量的三倍體。北京林業大學采用40～44 ℃的高溫和-2 ℃低溫的極端溫度的方法誘導毛新楊、銀毛楊（P. alba × P. tomentosa）、銀腺楊（P. alba × P. glandulosa）雌花芽，結果證明均可產生三倍體植株，并確定了處理雌花芽的最佳時期為水培的1～5d。后經試驗證明所獲三倍體植株具有較好的生長勢。他們還利用40 ℃高溫處理雄花芽得到66.25%的2n花粉[26，27]。

1.3 自然環境下篩選

利用自然變異，優中選優是植物種質改良的常用方法。在自然條件下，性母細胞在減數分裂過程中由于受到外界條件的影響，染色體沒有被分到兩個細胞中去，致使在后期花粉受精后，得到了三倍體的后代。1992-1995年，康向陽[28]對保留的無性系中長勢較好的60株毛白楊優良無性系進行鏡檢，發現5株為三倍體，染色體數2n=3x=57，是國內首次在自然界中發現楊樹三倍體，為中國楊樹多倍體育種做出重要貢獻。通過大量篩選，雖然可從自然界直接獲取多倍體植株，但是這種變異發生概率極低，導致篩選的工作量較大，往往在實踐中不采用這種方式獲得多倍體。

1.4 不同倍性的楊樹雜交

不同倍性的楊樹雜交培育多倍體是獲得楊樹多倍體的常規思路，當楊樹中存在不同倍性的可育植株時，直接通過雜交可以簡單快捷地獲得多倍體。例如利用四倍體與二倍體雜交就有機會產生三倍體，操作簡單，易于掌握，雜交后產生的后代的純合體，便于后續研究，但在雜交過程中由于雙方親本的倍性關系導致雜交可育性很低，獲得多倍體的數量少，因此不利于規模化育種。

1992年，康向陽等[16]用高溫處理楊樹花粉，得到2n花粉粒，然后與正常雌株雜交培育出三倍體。此后，李云等[27]采用極端溫度處理毛新楊、銀毛楊和銀腺楊誘導培育三倍體均取得成功。此種方式增加了2n配子的數量，從而提高了雜交后代三倍體的數量。康向陽[28]采用人工加倍獲得銀腺楊與毛新楊的2n花粉，并對其進行正交和反交，銀腺楊×毛新楊組合三倍體獲得率為3.8%；而毛新楊×銀腺楊組合則獲得12.9%的三倍體。經栽培試驗證明，獲得的兩種三倍體均有明顯的正向超親優勢。李云等[29]還采用秋水仙素誘導毛新楊、銀腺楊、銀毛楊使其雌配子染色體加倍，然后采用正常的花粉授粉，獲得了種子并培育成苗，經形態判斷和鏡檢成功選育13株三倍體植株，并在苗期具有明顯的速生性。此外研究發現響葉楊2n花粉的細胞學機制以后，采用高溫法使胚囊染色體加倍，然后授粉并以38 ℃的高溫處理，最后獲得三倍體誘導率高達83.33%[30]，并同時育出響葉楊四倍體，從而探索出了高效誘導楊樹三倍體的方法。

2 多倍體的鑒定

隨著多倍體育種技術的廣泛使用，多倍體鑒定技術也隨之發展。目前鑒定楊樹多倍體的方法有間接鑒定法和直接鑒定法。

2.1 間接鑒定法

間接鑒定法是通過楊樹形態觀察與二倍體進行比較，通常楊樹多倍體具有葉片大而厚、葉柄粗而長、葉綠體多、氣孔和保衛細胞大、纖維細胞增長等特征，可以初步判斷所獲得植株是多倍體[13]。楊樹多倍體的發現就是在天然的條件下，其表現出巨大性而引起了研究者的注意，所以間接地通過性狀對楊樹多倍體鑒定是有一定依據的，可以方便快捷地在眾多材料中進行初篩。張友鵬等[31]利用氣孔間接鑒定法鑒定誘導的多倍體楊樹。而國內其他學者在鑒定白楊雜種三倍體時提出根據苗期葉片形狀、葉緣鋸齒形、葉尖和葉基、主脈與葉基側脈夾角等形態指標初步鑒定三倍體的技術方法[32]。

近年來出現的流式細胞術（Flow cytometry， FCM）是一種對單細胞或其他生物粒子從功能水平升高進行細胞倍性檢測和分析的手段。該手段可以快速地分析上萬個細胞，因其方便、快捷、獲取數據準確，已經逐漸成為該領域的重要技術之一[12]。北京林業大學已成功地將流式細胞術應用于黑楊派和青楊派多倍體的鑒定中[33，34]。婁玲玲等[35]用大青楊為親本，雌花序授粉后施加0.2%～0.6%的秋水仙素，成功培育出大青楊同源三倍體，表現出有別于親本的優良性狀，并通過染色體鏡檢和流式細胞術法進行了鑒定。流式細胞儀有其他方法無法比擬的優越性，例如檢測速度快，可獲得多重數據，不使用同位素，無放射性污染等。但也有其不足之處，例如價格高昂，檢測費用高，儀器操作復雜，材料需要在短時間內進行檢測，否則會因為不穩定而導致數據失真等。此外，王君等[36]提出利用細胞間期染色中心數目的最大染色體數目對三倍體進行鑒定的標準，并用該法對青楊派楊樹倍性進行了鑒定。他們指出，中心數目大于40且小于60的植株鑒定為三倍體，大于60的鑒定為四倍體。此方法大大提高了倍性鑒定的效率，且多試驗材料要求不高。但是直接通過性狀判斷楊樹多倍體存在著可靠性低、不準確的特點，僅通過表現性狀鑒定具有很大的偶然性。表現型是通過基因和環境共同決定的，例如后天環境適于生長可能會表現出葉片大、葉柄粗、葉片顏色深等近似多倍體的特點，實際上多倍體楊樹也存在性狀上不及二倍體的現象，這就為間接鑒定帶來了難度。在實際的鑒定中，一般采用兩種或兩種以上的方法，這樣可以保證鑒定的準確性。有學者對于氣孔密度單一指標的可靠性較低問題提出了解決方案，指出綜合利用氣孔密度和氣孔面積兩個參數可以較準確地鑒定青楊派三倍體[33]。

2.2 直接鑒定法

楊樹多倍體的直接鑒定，即直接觀察染色體的數目，該鑒定途徑最為可靠。

染色體計數法對材料有較高要求，一般選取楊樹幼嫩莖尖或幼葉為材料，經解離、漂洗、染色、制片進行觀察。康向陽等[28]在0.2%秋水仙素和0.002 mol/L 8-羧基喹啉溶液中預處理3～5 h，然后轉入0.075 mol/L KCl溶液低滲處理0.5 h，洗滌，加入纖維素酶和果膠酶酶解3 h，洗滌，加入卡諾固定液，用鑷子將材料搗碎，再加入卡諾固定液制成細胞懸液，然后制片，觀察到明顯的棒狀結構的染色體。陳杰[24]利用秋水仙素結合組織培養技術獲得四倍體滇楊，并通過形態特征、染色體數量以及氣孔大小對多倍體進行了驗證，結果證明秋水仙素結合組織培養的方式對于楊樹多倍體誘導具有很好的效果，他們發現，誘變后的植株與二倍體相比，染色體數目增加到了76條。

此類多倍體鑒定方法的特點是能比較直觀地判斷倍性關系，試驗器材簡單，試驗易于進行，是目前仍較為廣泛使用的多倍體方法。但二倍體楊樹染色體數較多（2n=2X=38），對其加倍后染色體形態及數目就更不易鑒定。因此，建立高效穩定的染色體制片技術是利用該方法實現準確鑒定的前提。

3 問題及建議

楊樹多倍體育種是目前較為有效的楊樹遺傳改良手段，現已在楊樹新種質創育方面取得了一定的成就。但在育種過程中仍存在著一些理論及方法上的問題。

3.1 秋水仙素誘導的結果

秋水仙素是目前誘導效果最好的誘變劑。但也存在著一些不足之處，秋水仙素適用于獲取同源偶數倍性體，理論上是由二倍體誘導為四倍體。但康向陽等[16]以銀腺楊為母本，毛白楊為父本進行授粉，并用秋水仙素處理，意外獲得了白楊三倍體植株，其作用機理仍不清楚。采用秋水仙素等誘導劑進行誘導時，得到三倍體還是四倍體仍無法預測。因此，需進一步對秋水仙素誘變的相關機理進行更深層的研究，以提高誘變效果的可預見性。

3.2 2n花粉的誘導

采用2n花粉粒雜交選育三倍體過程中，2n花粉粒誘導率低，在處理花粉粒時，處理時機難以掌握[37]，給誘導處理帶來了很大的障礙。而且得到2n花粉粒在雜交過程中要克服單性花粉的競爭，往往導致成功率較低。所以，今后需要加大力度，重點解決如何高效誘導競爭力強的2n花粉，以提高多倍體的得率。

3.3 嵌合體的分離

不論是通過秋水仙素處理種子、頂芽，還是秋水仙素結合組織培養進行多倍體材料的誘導，均存在產生一定量嵌合體的現象。嵌合體在后期大多會恢復為正常二倍體。因此，需要建立快速有效的初篩方法（例如分子標記、流式細胞術等），并利用楊樹易于無性繁殖的特性，在早期對嵌合體中的誘變部分進行分離，并通過嫁接、扦插及組織培養等手段將其多倍化性狀加以固定。

3.4 后續工作的堅持

育種工作取得的成功，不僅僅是在前人已有工作基礎上進行的繼續研究，而是對自己前期工作的持之以恒。尤其對生命周期較長的林木來說，這項工作需時更長。通過染色體加倍獲得的楊樹多倍體材料，要經過多年無性系測定，依育種目標多代選擇，其優良性狀的穩定性才能最終被確認。因此，需要楊樹育種工作者兢兢業業，堅持不懈地完成這項工作，切忌急于求成，半途而廢。只有這樣，才能最終取得成功，選育出新的優良楊樹品種。

參考文獻：

[1]孫靜賢，丁開宇，王兵益.植物多倍體研究的回顧與展望[J].武漢植物學研究，2005，23（5）：482-490.

[2] 康向陽.林木多倍體育種研究進展[J].北京林業大學學報，2003， 25（4）：70-74.

[3] EHRENDORFER F. Polyploidy and distribution[J]. Basic Life Sci， 1979， 13：45-60.

[4] RAMSEY J， SCHEMSKE D W. Neopolyploidy in flowering plants[J]. Ann Rev Ecol Syst，2002，33：589-639.

[5] JOHNSSON H. Development of triploid and diploid populus tremula during the juvenile period[J]. Z Forstgenet，1953， 2（4）：73-77.

[6] 朱之悌，林惠斌，康向陽.毛白楊異源三倍體B301等無性系選育的研究[J].林業科學，1995，31（6）：499-505.

[7] 朱之悌，康向陽，張志毅.毛白楊天然三倍體選種研究[J].林業科學，1998，34（4）：22-31.

[8] 張志毅，李鳳蘭.白楊染色體加倍技術研究及三倍體育種（I）花粉染色體加倍技術[J].北京林業大學學報，1992，14（增刊）：52-58.

[9] EINSPAHR D W， BENSON M K， PECKILAM J R. Natural variation and heritability in triploid aspen[J]. Silvae Genet，1963，12（2）：51-58.

[10] 朱之悌.毛白楊遺傳改良[M].北京：中國林業出版社，2006. 228-239.

[11] 康向陽，朱之悌.三倍體毛白楊在我國紙漿生產中的地位與作用[J].北京林業大學學報，2002，10（24）：51-56.

[12] 康向陽，王 君.楊樹多倍體誘導技術研究[M].北京：科學出版社，2010. 1-159.

[13] 李 云，馮大領.木本植物多倍體育種研究進展[J].植物學通報，2005，22（3）：375-382.

[14] 黃權軍，張志毅，康向陽.四種抗微管物質誘導毛新楊2n花粉粒的研究[J].北京林業大學學報，2002，24（1）：12-15.

[15] 康向陽，張平冬，高 鵬，等.秋水仙堿誘導白楊三倍體新途徑的發現[J].北京林業大學學報，2004，26（1）：1-4.

[16] 康向陽，朱之悌，張志毅.銀腺楊與毛新楊正反交三倍體選育[J].北京林業大學學報，2000，22（6）：8-11.

[17] JOHNSSON H， EKLUNDH C. Colchicine treatment as a method in breeding hardwood species[J]. Svensk Papp Tidn，1940， 43：373-377.

[18] MASHKINA O S， BURDAEVA L M， BELOZEROVA M M， et al. Method of obtaining diploid pollen of woody species[J]. Lesovedenie，1989，1：19-25.

[19] BAUMEISTER G. Beispiele der polyploidie-Züchtung[J].Allgemeine Forstzeit Schrift，1980，26：697-699.

[20] 王 君，康向陽，李代麗，等.授粉后施加秋水仙堿處理誘導青楊派異源三倍體[J].北京林業大學學報，2007，29（5）：18-21.

[21] EINSPAHR D W. Colchicine treatment of newly formed embryos of quaking aspen[J]. Forest Science，1965， 11（4）：456-459.

[22] 高彩云，潘惠新，賈 恒，等.美洲黑楊×小葉楊雜種多倍體誘導研究[J].西北植物學報，2010，30（1）：50-55.

[23] 劉 巖.滇楊的組織培養及其多倍體誘導[D].昆明：西南林業大學，2011.

[24] 陳 杰.滇楊多倍體種質的誘導及鑒定[D].昆明：西南林業大學，2013.

[25] 陳 杰，周 軍，孫正海，等.組織培養結合秋水仙素誘導滇楊多倍體的研究[J].云南農業大學學報，2013，28（2）：251-256.

[26] 石 樂，張平冬，毛彥科，等.高溫處理誘導染色體加倍獲得白楊雜種多倍體[J].核農學報，2012，26（8）：1118-1123.

[27] 李 云，朱之悌，田硯亭，等.極端溫度處理白楊雌花芽培育三倍體植株的研究[J].北京林業大學學報，2000，22（5）：7-12.

[28] 康向陽.楊樹染色體數目和形態觀察[J].甘肅農業大學學報，1996，31（1）：67-70.

[29] 李 云，朱之悌，田硯亭，等.秋水仙堿處理白楊雌花芽培育三倍體植株的研究[J].林業科學，2001，37（5）：68-74.

[30] 魯 敏.響葉楊三倍體和四倍體誘導技術研究[D].北京：北京林業大學，2013.

[31] 張友鵬，李際紅，劉國興.楊樹多倍體誘導及氣孔檢測初報[J].山東林業科技，1998（6）：12-15.

[32] 尹敏娟.白楊雜種三倍體無性系形態鑒定及指紋圖譜構建[D].北京：北京林業大學，2011.

[33] 王 君，康向陽，李代麗.楊樹染色中心數目及其與倍性水平關系研究[J].西北植物學報，2008，28（10）：1967-1971.

[34] 張金鳳.黑楊2n花粉的形成機制與誘導技術研究[D].北京： 北京林業大學，2006.

[35] 婁玲玲，趙 慧，祁傳磊，等.秋水仙素誘導大青楊同源三倍體[J].植物生理學報，2011，47（7）：699-704.

[36] 王 君.青楊派樹種多倍體誘導技術研究[D].北京：北京林業大學，2009.

[37] 李艷華，康向陽.誘導大孢子染色體加倍選育白楊雜種三倍體[J].北京林業大學學報，2007，29（5）：22-25.