草莓鑲脈病毒粒子提取及電鏡觀察

肖文斐+裘劼人+柳愛春等

摘要：從受感染的草莓（Fragaria sp）植株中提取了草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，SVBV）粒子并對其進行了電鏡觀察。用CTAB法從草莓葉片中提取總核酸，設計SVBV外殼蛋白基因特異性引物，利用PCR方法對杭州地區的草莓鑲脈病毒感染情況進行檢測。檢測結果表明，在杭州地區大田種植的草莓中存在SVBV感染現象。從4株受感染草莓植株中分離克隆了SVBV的CP基因片段并測序；序列比較分析發現它們與已報道的美國SVBV分離物的CP基因（序列號NC_001725）核苷酸同源性為91%。利用差速離心法從上述草莓植株的葉片中提純SVBV病毒，在透射電鏡下觀察到SVBV病毒粒子呈球形，直徑約為40～55 nm。

關鍵詞：草莓鑲脈病毒（SVBV）；PCR檢測；病毒提取；電鏡觀察

中圖分類號：S432.4+1；S431.192 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4313-03

草莓鑲脈病毒（Strawberry vein banding virus，簡稱SVBV）在世界上分布廣泛，對草莓（Fragaria sp）危害較為嚴重，也是中國草莓生產的主要病毒病害之一，在吉林、河南、河北、遼寧、山東等地區均有發生[1，2]。SVBV在分類上屬花椰菜花葉病毒（Caulimoviruses，CaMV），是一種雙鏈DNA病毒，以半持久性方式通過蚜蟲或嫁接傳播。SVBV侵染可削弱草莓生長勢，降低產量及品質；而與其他病毒或細菌、真菌復合侵染則會造成嚴重病害發生，給草莓的生產帶來嚴重損失[3，4]。

Petrzik等[5]1998年測定了SVBV美國加州分離物的全基因組序列，并在此基礎上發展了該病毒的PCR檢測。目前，國內外眾多研究者已利用PCR方法檢測了不同的SVBV分離物[6-12]。研究表明，由于SVBV來源、地域不同，基因組存在著分子變異，分子檢測方法也有所不同。其中，外殼蛋白在SVBV中的保守性較好，不同地區中SVBV不同分離物外殼蛋白基因間分子變異較小，通常作為PCR檢測的首選區域。

雖然已對SVBV建立了高效、靈敏的PCR檢測方法。但在開展大規模病毒調查時，血清學檢測手段則更加簡單和實用。目前SVBV仍無商品化的抗血清檢測試劑，酶聯免疫吸附測定（ELISA）檢測較難實施。本研究用超速離心法從感染草莓鑲脈病毒（SVBV）的草莓葉片中提純SVBV病毒，為進一步制備SVBV抗血清和單克隆抗體提供有效的抗原基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

從浙江杭州地區采集帶疑似病癥和無癥狀草莓植株，盆栽種植于大棚，選取新鮮草莓葉片作為試驗材料。草莓品種為紅頰。

1.2 方法

1.2.1 病毒檢測

1）草莓葉片總核酸提取 參照文獻[11]采用改進的CTAB法抽提草莓總核酸。將少量草莓葉片在液氮中迅速研碎，取約50 mg粉末加入盛有500 μL CTAB提取緩沖液（2% CTAB；100 mmol Tris， pH 8.0；20 mmol EDTA；1.4 mmol NaCl；使用前加入2%β-巰基乙醇）的1.5 mL Eppendorf 管中，65 ℃水浴20 min。用等體積氯仿/異戊醇（24︰1）抽提2次，上清液中加入1/10體積的3 mmol/L NaAc（pH 5.2）、2.5倍體積無水乙醇，反復顛倒數次，取沉淀。70%乙醇洗滌沉淀2次，放置在超凈工作臺上吹干，加入50 μL DEPC水溶解。用紫外分光光度計測定其OD260 nm。

2）PCR反應體系 根據GenBank中的SVBV基因組序列，參照文獻[12]設計同源引物B1F（5′-GAATGGGACAATGAAATGAG-3′）和B1R（5′- GTGAGGAGAACTTAGGACA-3′）。所用引物由上海英駿生物工程技術服務有限公司合成。PCR反應體系總體積為20.0 μL，其中包括模板DNA 1.0 μL、引物（10 μmol/L）0.5 μL， Taq DNA聚合酶（5 U/μL） 0.2 μL，dNTP（10 mmol/L） 0.4 μL，10×PCR Buffer（含 25 mmol/L MgCl2） 2.0 μL，ddH2O 13.4 μL。所用試劑購于寶生物（大連）生物工程有限公司。擴增程序為： 94 ℃ 預變性3 min；94 ℃變性1 min，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共35個循環；72 ℃延伸7 min，4 ℃保存。

3）目的片段的克隆及測序 利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒[生工生物工程（上海）股份有限公司產品]從凝膠中回收目的片段，與pUC19-T Easy載體連接，然后轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞。經藍白斑篩選，挑取白色菌落培養，提取質粒，通過PCR鑒定陽性克隆。測序工作委托生工生物工程（上海）股份有限公司進行。獲得的序列用BLAST在GenBank中進行檢索分析，利用軟件CLUSTAL 1.83進行多序列比對。

1.2.2 病毒純化 參照文獻[13]中花椰菜花葉病毒的提取方法進行操作。收集100～200 g新鮮草莓葉片，置于200 mL 0.5 μmol/L 的磷酸鈉（pH 7.2）溶液中磨成勻漿，每100 g勻漿加入0.75 g亞硫酸鈉，冰上操作；將勻漿倒入燒杯中，每100 mL勻漿加入6 g尿素和25 mL Triton X-100， 4 ℃攪拌過夜；4 ℃ 4 000 g離心10 min；輕柔地用4層紗布過濾，將液體倒入離心管，4 ℃ 7 000 g離心2 h；倒棄上清液，每管用 1mL滅菌去離子水重懸沉淀1～2 h；收集重懸液，用微型離心機離心2次，去除不溶顆粒；將上清液用去離子水稀釋到一定體積，13 600 g 4 ℃離心1 h；用0.01 mol/L磷酸緩沖液（pH 7.0）重懸病毒粒子，4 ℃或-20 ℃保存。紫外分光光度計測定其OD260 nm。

1.2.3 電鏡觀察 將病毒提純液（5 uL）置于2%磷鎢酸溶液（pH 6.8）中負染約30 min，用JEM-1230型透射電鏡進行觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 草莓總核酸情況

采用改進的CTAB法抽提的草莓葉片總核酸沉淀呈乳白色，易溶于水，不黏稠，多糖含量較少。經紫外分光光度計測定，核酸濃度為120～400 ng/uL，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之間。經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其DNA條帶清晰，完整性較好（圖1）。

2.2 PCR產物電泳分析

以提取的草莓總核酸為模板，用引物（B1F、B1R）進行PCR反應，擴增獲得了與預期片段（574 bp）大小一致的擴增產物。2012年從浙江杭州地區采集可疑癥狀樣品和部分無癥狀樣品共48份，共檢出帶SVBV陽性材料24份。其中，多代苗中草莓病毒侵染率約為42.8%，而一代苗和二代苗中病毒侵染率低于10.0%；田間曾感染過真菌或細菌病害的草莓病毒侵染率較高，最高的為82.5%，未明顯發病區域的病毒侵染率在10%～28%之間。

2.3 基因片段序列測定

選取來源于不同植株的4個陽性克隆進行測序，測序結果表明，4個克隆片段的序列完全一致，序列總長574 bp，在NCBI網站（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov）上進行Blast分析，發現該序列與GenBank中的已知SVBV序列同源。與中國鄭州分離物（序列號AY862389）核苷酸同源性最高，為95%；與沈陽分離物（序列號AY955374）同源性為94%，而與美國分離物（序列號NC_001725）同源性為91%。而該區段對應的蛋白質序列與上述3個分離物同源性分別為99%、98%和98%。將測序結果提交GenBank獲得序列號KJ774105，同時將此次采集的SVBV分離物定為杭州分離物。

2.4 病毒純化情況

病毒具有特有的紫外吸收峰，通過紫外分光光度計可以測定推算病毒濃度[14]。采用微量分光光度計測量SVBV病毒提純液的紫外吸收光譜，發現其OD260 nm為1.454，OD260 nm/OD280 nm為1.41。資料顯示[13]，花椰菜花葉病毒消光系數E（0.1%、1 cm、260 nm）為7，根據公式，病毒濃度（mg/mL）=OD260 nm×稀釋倍數/E，推算出提純的病毒濃度約為0.2 mg/mL。

2.5 病毒粒子的形態

病毒提純液用2%磷鎢酸溶液負染后，在透射電鏡下可觀察到球形的病毒粒子，直徑約為40～55 nm，粒子中心可見清晰核心（圖2）。該病毒粒子形態與已報道的花椰菜花葉病毒的病毒粒子非常吻合。而對照健康楊葉未觀察到類似顆粒。

3 小結與討論

SVBV是我國草莓的主要病毒病害之一，在吉林、河南、河北、遼寧、山東等地區均有發生，但經檢索，未發現在浙江草莓種植區發生該病的報道。本研究發現，杭州地區栽培草莓中也存在SVBV感染。其中，多代苗的侵染率高于低代苗，而炭疽病等真菌感染、蚜蟲數量多也會增加SVBV感染率。因此，田間草莓鑲脈病毒的防治首先要選取無病毒低代苗作為種苗，同時要注意蚜蟲和其他病害的防治。

前人研究表明[6，11，15]，SVBV存在株系分化現象，不同基因型在不同生態地理條件下核酸序列存在變化，即使比較保守的CP基因也有核苷酸的改變。本研究通過序列分析，發現SVBV杭州分離物與鄭州分離物同源性最高，與沈陽分離物次之，與美國分離物同源性最低。由此推測，不同株系間基因序列的變異可能是地域差異造成的。因此，在病毒PCR檢測的實踐中，特異引物的選擇設計尤其重要，同時參考幾對引物的擴增結果有助于假陰性的識別。

SVBV屬花椰菜花葉病毒。在本研究中，參考改進的花椰菜花葉病毒提純方法[13]，在受侵染的草莓葉片中提純得到了SVBV病毒。目前，還未有商業化的SVBV抗體研制成功，限制了該病毒的血清學檢測。江彤等[16，17]采用通過原核表達獲得目的蛋白再免疫兔子的方式制備了SVBV的抗血清。由于利用提純病毒制備的抗血清本底低、效價高，通過商業途徑銷售的抗血清多傾向于利用提純病毒制備。后期研究可用提純的病毒粒子研究制備抗血清，為該病毒的血清學檢測奠定基礎。

參考文獻：

[1] 王國平，劉福昌，國際翔.我國草莓主栽區病毒種類的鑒定[J].植物病理學報，1991，21（1）：9-14.

[2] HONETSLEGROVA J，MRAZ I，SPAK J.Detection and isolation of strawberry vein banding virus in the Czech Republic[J].Acta Hortie，1995，385：29-32.

[3] MORRIS T J，MULLIN R H，SCHLEGEL D E.Isolation of a caulimovirus from strawberry tissue infected with strawberry vei banding virus[J]. Phytopathology，1980，70：156-160.

[4] MASS J L.草莓病蟲害概論[M].第二版.張運濤，張國珍，譯.北京：中國農業出版社，2012.

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[9] 陳曉軍，王敬東，馬洪愛，等.草莓鑲脈病毒檢測方法研究[J].北方園藝，2010 （22）：123-125.

[10] 隋 春，吳祿平，張志宏.利用PCR技術檢測草莓鑲脈病毒[J].園藝學報，2003，30（1）：82-84.

[11] 肖 敏，張志宏，代紅艷，等.PCR檢測草莓鑲脈病毒的穩定性研究[J].果樹學報，2005，22（5）：483-487.

[12] 周厚成，李思源，何水濤，等.草莓鑲脈病毒的PCR檢測及特異片段的序列分析[J].果樹學報，2005，22（3）：286-288.

[13] HULL R，SHEPHERD R J.Cauliflower mosaic virus： An improved purification procedure and some properties of the virus particles[J].Journal of general virology，1976，31：93-100.

[14] 章紹延，王健華，譚老喜，等.一辣椒環斑病毒提純及抗血清制備[J].熱帶作物學報，2013，34（3）：534-537.

[15] 洪 健，李德葆，周雪平.植物病毒分類圖譜[M].北京：科學出版社，2001.

[16] 江 彤，楊友志，丁 菲，等.草莓鑲脈病毒外殼蛋白的原核表達及多抗血清制備[J].南京農業大學學報，2012，35（6）：30-34.

[17] 江 彤，謝朝陽，丁 菲，等.草莓鑲脈病毒ORF Ⅵ基因的原核表達與抗血清制備[J].植物保護學報，2013，40（6）：511-516.

1.2.3 電鏡觀察 將病毒提純液（5 uL）置于2%磷鎢酸溶液（pH 6.8）中負染約30 min，用JEM-1230型透射電鏡進行觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 草莓總核酸情況

采用改進的CTAB法抽提的草莓葉片總核酸沉淀呈乳白色，易溶于水，不黏稠，多糖含量較少。經紫外分光光度計測定，核酸濃度為120～400 ng/uL，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之間。經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其DNA條帶清晰，完整性較好（圖1）。

2.2 PCR產物電泳分析

以提取的草莓總核酸為模板，用引物（B1F、B1R）進行PCR反應，擴增獲得了與預期片段（574 bp）大小一致的擴增產物。2012年從浙江杭州地區采集可疑癥狀樣品和部分無癥狀樣品共48份，共檢出帶SVBV陽性材料24份。其中，多代苗中草莓病毒侵染率約為42.8%，而一代苗和二代苗中病毒侵染率低于10.0%；田間曾感染過真菌或細菌病害的草莓病毒侵染率較高，最高的為82.5%，未明顯發病區域的病毒侵染率在10%～28%之間。

2.3 基因片段序列測定

選取來源于不同植株的4個陽性克隆進行測序，測序結果表明，4個克隆片段的序列完全一致，序列總長574 bp，在NCBI網站（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov）上進行Blast分析，發現該序列與GenBank中的已知SVBV序列同源。與中國鄭州分離物（序列號AY862389）核苷酸同源性最高，為95%；與沈陽分離物（序列號AY955374）同源性為94%，而與美國分離物（序列號NC_001725）同源性為91%。而該區段對應的蛋白質序列與上述3個分離物同源性分別為99%、98%和98%。將測序結果提交GenBank獲得序列號KJ774105，同時將此次采集的SVBV分離物定為杭州分離物。

2.4 病毒純化情況

病毒具有特有的紫外吸收峰，通過紫外分光光度計可以測定推算病毒濃度[14]。采用微量分光光度計測量SVBV病毒提純液的紫外吸收光譜，發現其OD260 nm為1.454，OD260 nm/OD280 nm為1.41。資料顯示[13]，花椰菜花葉病毒消光系數E（0.1%、1 cm、260 nm）為7，根據公式，病毒濃度（mg/mL）=OD260 nm×稀釋倍數/E，推算出提純的病毒濃度約為0.2 mg/mL。

2.5 病毒粒子的形態

病毒提純液用2%磷鎢酸溶液負染后，在透射電鏡下可觀察到球形的病毒粒子，直徑約為40～55 nm，粒子中心可見清晰核心（圖2）。該病毒粒子形態與已報道的花椰菜花葉病毒的病毒粒子非常吻合。而對照健康楊葉未觀察到類似顆粒。

3 小結與討論

SVBV是我國草莓的主要病毒病害之一，在吉林、河南、河北、遼寧、山東等地區均有發生，但經檢索，未發現在浙江草莓種植區發生該病的報道。本研究發現，杭州地區栽培草莓中也存在SVBV感染。其中，多代苗的侵染率高于低代苗，而炭疽病等真菌感染、蚜蟲數量多也會增加SVBV感染率。因此，田間草莓鑲脈病毒的防治首先要選取無病毒低代苗作為種苗，同時要注意蚜蟲和其他病害的防治。

前人研究表明[6，11，15]，SVBV存在株系分化現象，不同基因型在不同生態地理條件下核酸序列存在變化，即使比較保守的CP基因也有核苷酸的改變。本研究通過序列分析，發現SVBV杭州分離物與鄭州分離物同源性最高，與沈陽分離物次之，與美國分離物同源性最低。由此推測，不同株系間基因序列的變異可能是地域差異造成的。因此，在病毒PCR檢測的實踐中，特異引物的選擇設計尤其重要，同時參考幾對引物的擴增結果有助于假陰性的識別。

SVBV屬花椰菜花葉病毒。在本研究中，參考改進的花椰菜花葉病毒提純方法[13]，在受侵染的草莓葉片中提純得到了SVBV病毒。目前，還未有商業化的SVBV抗體研制成功，限制了該病毒的血清學檢測。江彤等[16，17]采用通過原核表達獲得目的蛋白再免疫兔子的方式制備了SVBV的抗血清。由于利用提純病毒制備的抗血清本底低、效價高，通過商業途徑銷售的抗血清多傾向于利用提純病毒制備。后期研究可用提純的病毒粒子研究制備抗血清，為該病毒的血清學檢測奠定基礎。

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[11] 肖 敏，張志宏，代紅艷，等.PCR檢測草莓鑲脈病毒的穩定性研究[J].果樹學報，2005，22（5）：483-487.

[12] 周厚成，李思源，何水濤，等.草莓鑲脈病毒的PCR檢測及特異片段的序列分析[J].果樹學報，2005，22（3）：286-288.

[13] HULL R，SHEPHERD R J.Cauliflower mosaic virus： An improved purification procedure and some properties of the virus particles[J].Journal of general virology，1976，31：93-100.

[14] 章紹延，王健華，譚老喜，等.一辣椒環斑病毒提純及抗血清制備[J].熱帶作物學報，2013，34（3）：534-537.

[15] 洪 健，李德葆，周雪平.植物病毒分類圖譜[M].北京：科學出版社，2001.

[16] 江 彤，楊友志，丁 菲，等.草莓鑲脈病毒外殼蛋白的原核表達及多抗血清制備[J].南京農業大學學報，2012，35（6）：30-34.

[17] 江 彤，謝朝陽，丁 菲，等.草莓鑲脈病毒ORF Ⅵ基因的原核表達與抗血清制備[J].植物保護學報，2013，40（6）：511-516.

1.2.3 電鏡觀察 將病毒提純液（5 uL）置于2%磷鎢酸溶液（pH 6.8）中負染約30 min，用JEM-1230型透射電鏡進行觀察拍照。

2 結果與分析

2.1 草莓總核酸情況

采用改進的CTAB法抽提的草莓葉片總核酸沉淀呈乳白色，易溶于水，不黏稠，多糖含量較少。經紫外分光光度計測定，核酸濃度為120～400 ng/uL，OD260 nm/OD280 nm在1.8～2.0之間。經0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，其DNA條帶清晰，完整性較好（圖1）。

2.2 PCR產物電泳分析

以提取的草莓總核酸為模板，用引物（B1F、B1R）進行PCR反應，擴增獲得了與預期片段（574 bp）大小一致的擴增產物。2012年從浙江杭州地區采集可疑癥狀樣品和部分無癥狀樣品共48份，共檢出帶SVBV陽性材料24份。其中，多代苗中草莓病毒侵染率約為42.8%，而一代苗和二代苗中病毒侵染率低于10.0%；田間曾感染過真菌或細菌病害的草莓病毒侵染率較高，最高的為82.5%，未明顯發病區域的病毒侵染率在10%～28%之間。

2.3 基因片段序列測定

選取來源于不同植株的4個陽性克隆進行測序，測序結果表明，4個克隆片段的序列完全一致，序列總長574 bp，在NCBI網站（http：//blast.st-va.ncbi.nlm.nih.gov）上進行Blast分析，發現該序列與GenBank中的已知SVBV序列同源。與中國鄭州分離物（序列號AY862389）核苷酸同源性最高，為95%；與沈陽分離物（序列號AY955374）同源性為94%，而與美國分離物（序列號NC_001725）同源性為91%。而該區段對應的蛋白質序列與上述3個分離物同源性分別為99%、98%和98%。將測序結果提交GenBank獲得序列號KJ774105，同時將此次采集的SVBV分離物定為杭州分離物。

2.4 病毒純化情況

病毒具有特有的紫外吸收峰，通過紫外分光光度計可以測定推算病毒濃度[14]。采用微量分光光度計測量SVBV病毒提純液的紫外吸收光譜，發現其OD260 nm為1.454，OD260 nm/OD280 nm為1.41。資料顯示[13]，花椰菜花葉病毒消光系數E（0.1%、1 cm、260 nm）為7，根據公式，病毒濃度（mg/mL）=OD260 nm×稀釋倍數/E，推算出提純的病毒濃度約為0.2 mg/mL。

2.5 病毒粒子的形態

病毒提純液用2%磷鎢酸溶液負染后，在透射電鏡下可觀察到球形的病毒粒子，直徑約為40～55 nm，粒子中心可見清晰核心（圖2）。該病毒粒子形態與已報道的花椰菜花葉病毒的病毒粒子非常吻合。而對照健康楊葉未觀察到類似顆粒。

3 小結與討論

SVBV是我國草莓的主要病毒病害之一，在吉林、河南、河北、遼寧、山東等地區均有發生，但經檢索，未發現在浙江草莓種植區發生該病的報道。本研究發現，杭州地區栽培草莓中也存在SVBV感染。其中，多代苗的侵染率高于低代苗，而炭疽病等真菌感染、蚜蟲數量多也會增加SVBV感染率。因此，田間草莓鑲脈病毒的防治首先要選取無病毒低代苗作為種苗，同時要注意蚜蟲和其他病害的防治。

前人研究表明[6，11，15]，SVBV存在株系分化現象，不同基因型在不同生態地理條件下核酸序列存在變化，即使比較保守的CP基因也有核苷酸的改變。本研究通過序列分析，發現SVBV杭州分離物與鄭州分離物同源性最高，與沈陽分離物次之，與美國分離物同源性最低。由此推測，不同株系間基因序列的變異可能是地域差異造成的。因此，在病毒PCR檢測的實踐中，特異引物的選擇設計尤其重要，同時參考幾對引物的擴增結果有助于假陰性的識別。

SVBV屬花椰菜花葉病毒。在本研究中，參考改進的花椰菜花葉病毒提純方法[13]，在受侵染的草莓葉片中提純得到了SVBV病毒。目前，還未有商業化的SVBV抗體研制成功，限制了該病毒的血清學檢測。江彤等[16，17]采用通過原核表達獲得目的蛋白再免疫兔子的方式制備了SVBV的抗血清。由于利用提純病毒制備的抗血清本底低、效價高，通過商業途徑銷售的抗血清多傾向于利用提純病毒制備。后期研究可用提純的病毒粒子研究制備抗血清，為該病毒的血清學檢測奠定基礎。

參考文獻：

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