甘南高原野生與人工栽培翼首草根部多糖含量測定

丁耀光+馬富花+付育紅

摘要：翼首草[Pterocephalus hookeri （Clarke） Hoeck]系川續斷科翼首花屬植物匙葉翼首花全草，富含植物多糖，塊根可入藥。通過超聲波提取法從翼首草根部提取多糖，采用苯酚-硫酸比色法對其含量進行測定。結果表明，超聲波提取的甘南高原野生翼首草的多糖含量為18.78 mg/100 mL，超聲波提取的甘南高原人工栽培翼首草多糖含量為20.63 mg/100 mL，可見人工栽培翼首草根部多糖含量明顯高于野生的。

關鍵詞：翼首草[Pterocephalus hookeri （Clarke） Hoeck]；多糖含量；甘南高原；人工栽培

中圖分類號：O629.12 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4361-03

翼首草[Pterocephalus hookeri （Clarke） Hoeck]系川續斷科翼首花屬植物匙葉翼首花全草，為常用藏藥，藏語名為“榜孜毒烏、榜子毒烏、榜孜奪吾”等，為著名藏藥“潔白丸”的主要成分之一。味苦、性寒，有小毒，有解毒、清熱止痢、祛風除痹之功效。藏醫常用它來治療感冒發熱及各種溫熱病引起的發燒，心中煩熱，咳血、吐血、尿血、便血等癥[1，2]。全世界翼首花屬植物約25種，我國主要有匙葉翼首花和裂葉翼首花2種，分布于云南、四川、甘肅、青海和西藏東部海拔3 000 m以上的向陽地、草地、林間、林緣[3]。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 原料 翼首草采自甘肅省甘南藏族自治州合作市。該區域地處青藏高原東北部邊緣，位于102°53′E、34°57′N，海拔高度為2 963 m。冬季寒冷而漫長，夏季溫暖而短暫，全年日照充足，平均氣溫為-0.5～3.5 ℃，最高氣溫為28 ℃，最低氣溫為-23 ℃，平均無霜期為48 d，平均年降水量為545 mm，一般集中于7～9月。該地區屬于亞高寒草甸濕潤類型，適合生長多種雙子葉、禾本科和莎草科植物。

1.1.2 藥品與儀器 藥品：40 g/L苯酚溶液、葡萄糖、正丁醇、石油醚、三氯甲烷、濃硫酸、乙醇，均為國產分析純。儀器：CMD-20X型智能型電熱恒溫鼓風干燥箱、ORW1.5S-3E型微波萃取機、RE-52AA型上海亞榮旋轉蒸發儀、天津華鑫SHZ-D（A）型循環水真空泵、離心機、分析天平（精確度為0.000 1 g）、HHS型數顯恒溫水浴鍋、攪拌器。

1.2 方法

1.2.1 樣品的預處理 將翼首草自然陰干，粉碎過20目篩，備用。采用粉碎法對匙葉翼首草樣品進行預處理，預處理之后再用Sevage法[4]脫脂，用水煮提取粗多糖，對粗多糖除蛋白質，用水提醇沉法[5]提取純凈多糖，即得到純凈的翼首草多糖[6]。比色法廣泛應用于多糖含量測定中，其中苯酚-硫酸比色法和蒽酮-硫酸比色法是試驗中測定多糖含量的常用方法[5]。而苯酚-硫酸比色法測定多糖含量的準確度較高，因此本研究選用此方法。

1.2.2 脂的脫除 稱取10 g制備好的翼首草樣品裝入圓底燒瓶中，加100 mL的石油醚（沸程60～90 ℃），在85.5 ℃的恒溫水浴中回流提取50 min，冷卻，離心4 min回收石油醚，重復兩次，晾干殘渣中華的溶劑，備用。

1.2.3 粗多糖的提取 在250 mL圓底燒瓶中加入去離子水和脫脂后的匙葉翼首草殘渣，以超聲波功率500 W、料液比1∶15（m/V，g∶mL）、提取時間30 min[7]提取1次，離心6 min，抽濾，收集濾液；再將濾液加入旋轉蒸發儀，重復兩次，濃縮至約30 mL。

1.2.4 蛋白質的去除 將上一步獲得的溶液倒入錐形瓶，加入三氯甲烷-正丁醇（體積比5∶1）混合溶液20 mL，攪拌20 min，離心7 min，收集上層溶液，本試驗共重復7次至無蛋白質沉淀出現。除去蛋白質的樣品用紫外分光光度計檢測，如果在波長280 nm處無吸收，表明蛋白質已經除盡[8]。

1.2.5 多糖的乙醇沉淀 將多糖離心后所得的溶液轉入100 mL量筒中，加入無水乙醇（溶液和無水乙醇的體積比為1∶5），將得到的多糖混合溶液靜置24 h，然后將溶液抽濾，收集濾渣，將濾渣真空干燥，得到翼首草多糖產品。

1.2.6 多糖含量的測定

1）測定方法。采用苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖為參照物，使用紫外可見分光光度計對制備出的產物的多糖含量進行測定。

2）最大吸收波長的確定。用移液管取適量樣品溶液，向其中加入顯色劑，在波長400～600 nm范圍內進行檢測[9]，繪制出吸收曲線。

3）最佳顯色時間的確定。顯色反應是較為復雜的有機反應，需要一定的時間才能顯色完全[10]。在不同的顯色時間下測定其吸光度，確定吸光度最大的顯色時間。

4）標準溶液的制備。標準溶液的配制方法是：稱取干燥至恒重的葡萄糖100 mg，溶解定容于100 mL的容量瓶中[11]，再用移液管吸取標準溶液0、2、4、6、8和10 mL，定容至100 mL容量瓶中。

5）標準曲線的繪制。取上述標準溶液1 mL于具塞試管中，分別加1 mL 40 g/L苯酚，快速加入7 mL濃硫酸，振蕩4 min，顯色30 min，于490 nm波長處測定吸光度，以二次去離子水作空白對照試驗，以Y軸為吸光度A，X軸為葡萄糖濃度（mg/mL），得到標準曲線。

6）換算因子的測定。精密稱取干燥至恒重的多糖樣品0.010 5 g，置于100 mL容量瓶中，定容。移取該溶液1 mL，定容于10 mL容量瓶中，即制得待測溶液。吸取1 mL待測液，顯色測定吸光度，依據回歸方程得到溶液中的葡萄糖濃度，由公式f=m/c×D計算得出f，其中m表示多糖質量（g），c表示多糖液中葡萄糖的濃度（mg/mL），D表示多糖稀釋倍數，即稀釋前的溶液濃度除以稀釋后的溶液濃度[12]。

7）3份待測樣品的制備。選取3份匙葉翼首草根部，用微波萃取機超聲波提取多糖，精密稱取干燥至恒重的多糖，定容至100 mL容量瓶中。將匙葉翼首草多糖3份樣品各吸取1 mL定容至100 mL容量瓶中，即制得1號、2號、3號樣品。

2 結果與分析

2.1 蛋白質的檢測

為了檢測樣品中蛋白質是否除盡，在波長280 nm[13]處用紫外分光光度計檢測，檢測結果表明紫外吸收為零，蛋白質已除盡。

2.2 多糖含量的測定

2.2.1 最大吸收波長的確定 由圖1的吸收曲線可知，最大吸收波長為490 nm。

2.2.2 最佳顯色時間的確定 由圖2可知，顯色30 min時有最大的吸光度，所以最佳顯色時間為30 min。

2.2.3 標準方程的獲得 標準曲線見圖3。標準曲線方程為y=0.047 6x+0.006 4，r=0.999 5。

2.2.4 換算因子的測定結果 根據回歸方程y=0.047 6x+0.006 4可知，多糖樣品的濃度為0.064 1 mg/mL，由換算因子公式f=m/c×D計算得到f=1.63 8。

2.2.5 野生樣品溶液中多糖含量的測定結果 分別從稀釋100倍的1號、2號、3號樣品中取1 mL溶液于具塞試管中，顯色測吸光度，每種樣品重復3次，每個重復試驗的吸光度分別記為A1、A2、A3，平均值為A，結果見表1。表1結果表明，3份樣品中多糖含量分別為18.96、18.41、18.96 mg/100 mL，說明測定誤差極小。

2.2.6 人工栽培樣品溶液中多糖含量的測定結果 分別從稀釋100倍的1號、2號、3號樣品中取1 mL溶液于具塞試管中，顯色測吸光度，每種樣品重復3次，每個樣的吸光度分別記為A1、A2、A3，平均值為A，結果見表2。表2結果表明，3份樣品中多糖含量分別為20.63、20.62、20.63 mg/100 mL，說明測定誤差極小。

3 小結與討論

通過超聲波提取甘南高原人工栽培翼首草根部多糖，提高了多糖的產率。在翼首草多糖含量的測定中，選用了苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖為對照品，使用紫外可見分光光度計測定制備出的產物中的葡萄糖含量。結果表明，超聲波提取甘的南高原野生翼首草中多糖的含量為18.78 mg/100 mL，超聲波提取的甘南高原人工栽培翼首草中多糖的含量為20.63 mg/100 mL，人工栽培翼首草根部中多糖的含量明顯高于野生的。

參考文獻：

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[13] 里跟林，杜天信，梁生旺.懷牛膝中多糖的量[J].中國實驗方劑雜志，2002，8（5）：6-7.

7）3份待測樣品的制備。選取3份匙葉翼首草根部，用微波萃取機超聲波提取多糖，精密稱取干燥至恒重的多糖，定容至100 mL容量瓶中。將匙葉翼首草多糖3份樣品各吸取1 mL定容至100 mL容量瓶中，即制得1號、2號、3號樣品。

2 結果與分析

2.1 蛋白質的檢測

為了檢測樣品中蛋白質是否除盡，在波長280 nm[13]處用紫外分光光度計檢測，檢測結果表明紫外吸收為零，蛋白質已除盡。

2.2 多糖含量的測定

2.2.1 最大吸收波長的確定 由圖1的吸收曲線可知，最大吸收波長為490 nm。

2.2.2 最佳顯色時間的確定 由圖2可知，顯色30 min時有最大的吸光度，所以最佳顯色時間為30 min。

2.2.3 標準方程的獲得 標準曲線見圖3。標準曲線方程為y=0.047 6x+0.006 4，r=0.999 5。

2.2.4 換算因子的測定結果 根據回歸方程y=0.047 6x+0.006 4可知，多糖樣品的濃度為0.064 1 mg/mL，由換算因子公式f=m/c×D計算得到f=1.63 8。

2.2.5 野生樣品溶液中多糖含量的測定結果 分別從稀釋100倍的1號、2號、3號樣品中取1 mL溶液于具塞試管中，顯色測吸光度，每種樣品重復3次，每個重復試驗的吸光度分別記為A1、A2、A3，平均值為A，結果見表1。表1結果表明，3份樣品中多糖含量分別為18.96、18.41、18.96 mg/100 mL，說明測定誤差極小。

2.2.6 人工栽培樣品溶液中多糖含量的測定結果 分別從稀釋100倍的1號、2號、3號樣品中取1 mL溶液于具塞試管中，顯色測吸光度，每種樣品重復3次，每個樣的吸光度分別記為A1、A2、A3，平均值為A，結果見表2。表2結果表明，3份樣品中多糖含量分別為20.63、20.62、20.63 mg/100 mL，說明測定誤差極小。

3 小結與討論

通過超聲波提取甘南高原人工栽培翼首草根部多糖，提高了多糖的產率。在翼首草多糖含量的測定中，選用了苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖為對照品，使用紫外可見分光光度計測定制備出的產物中的葡萄糖含量。結果表明，超聲波提取甘的南高原野生翼首草中多糖的含量為18.78 mg/100 mL，超聲波提取的甘南高原人工栽培翼首草中多糖的含量為20.63 mg/100 mL，人工栽培翼首草根部中多糖的含量明顯高于野生的。

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[13] 里跟林，杜天信，梁生旺.懷牛膝中多糖的量[J].中國實驗方劑雜志，2002，8（5）：6-7.

7）3份待測樣品的制備。選取3份匙葉翼首草根部，用微波萃取機超聲波提取多糖，精密稱取干燥至恒重的多糖，定容至100 mL容量瓶中。將匙葉翼首草多糖3份樣品各吸取1 mL定容至100 mL容量瓶中，即制得1號、2號、3號樣品。

2 結果與分析

2.1 蛋白質的檢測

為了檢測樣品中蛋白質是否除盡，在波長280 nm[13]處用紫外分光光度計檢測，檢測結果表明紫外吸收為零，蛋白質已除盡。

2.2 多糖含量的測定

2.2.1 最大吸收波長的確定 由圖1的吸收曲線可知，最大吸收波長為490 nm。

2.2.2 最佳顯色時間的確定 由圖2可知，顯色30 min時有最大的吸光度，所以最佳顯色時間為30 min。

2.2.3 標準方程的獲得 標準曲線見圖3。標準曲線方程為y=0.047 6x+0.006 4，r=0.999 5。

2.2.4 換算因子的測定結果 根據回歸方程y=0.047 6x+0.006 4可知，多糖樣品的濃度為0.064 1 mg/mL，由換算因子公式f=m/c×D計算得到f=1.63 8。

2.2.5 野生樣品溶液中多糖含量的測定結果 分別從稀釋100倍的1號、2號、3號樣品中取1 mL溶液于具塞試管中，顯色測吸光度，每種樣品重復3次，每個重復試驗的吸光度分別記為A1、A2、A3，平均值為A，結果見表1。表1結果表明，3份樣品中多糖含量分別為18.96、18.41、18.96 mg/100 mL，說明測定誤差極小。

2.2.6 人工栽培樣品溶液中多糖含量的測定結果 分別從稀釋100倍的1號、2號、3號樣品中取1 mL溶液于具塞試管中，顯色測吸光度，每種樣品重復3次，每個樣的吸光度分別記為A1、A2、A3，平均值為A，結果見表2。表2結果表明，3份樣品中多糖含量分別為20.63、20.62、20.63 mg/100 mL，說明測定誤差極小。

3 小結與討論

通過超聲波提取甘南高原人工栽培翼首草根部多糖，提高了多糖的產率。在翼首草多糖含量的測定中，選用了苯酚-硫酸比色法，以葡萄糖為對照品，使用紫外可見分光光度計測定制備出的產物中的葡萄糖含量。結果表明，超聲波提取甘的南高原野生翼首草中多糖的含量為18.78 mg/100 mL，超聲波提取的甘南高原人工栽培翼首草中多糖的含量為20.63 mg/100 mL，人工栽培翼首草根部中多糖的含量明顯高于野生的。

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