當歸輪作和連作根際土壤中致病菌變化研究

葉文斌+樊亮

摘要：以當歸（Angelica sinensis）“90-02”號為材料，采用大田試驗研究連作對當歸產量和品質的影響，并測定了未種植當歸的馬鈴薯田土壤（對照）和當歸-馬鈴薯-當歸輪作土壤、當歸-當歸連作土壤中尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）的數量。結果表明，連作導致當歸產量下降，其根鮮重、分根數均極顯著下降，根長顯著下降，對幼苗生長以及生理特性也有較大影響；當歸-馬鈴薯-當歸輪作土壤、當歸-當歸連作土壤中尖孢鐮刀菌數量比種植馬鈴薯田土壤（對照）的均極顯著增多，分別是對照土壤中的12.63和12.90倍，當歸-當歸連作土壤中尖孢鐮刀菌數量與當歸-馬鈴薯-當歸輪作土壤的相比也極顯著增多。結果表明，當歸連作障礙導致其產量和品質均顯著降低，尖孢鐮刀菌數量增多是引起當歸根腐病的主要原因，也可能是當歸發育生長的主要障礙因素之一。

關鍵詞：當歸（Angelica sinensis）；連作障礙；尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）；數量變化

中圖分類號：S567.53.044；Q945 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4364-04

連作障礙是指在正常的栽培管理措施下，同一塊地連續多年種植相同作物（連作）造成作物產量降低、品質變劣、生長狀況變差、病蟲害發生加劇的現象[1]。許多作物都存在連作障礙，如豆類、水果類和蔬菜類[1-5]，許多中藥材植物連作障礙也非常嚴重，如附子、地黃、丹參、蒼術、西洋參、紫蘇和薏苡等[6-10]。有研究認為連作障礙是作物根系分泌的自毒物質積累引起化感作用而導致的生長抑制作用[11]，也有學者認為植物的連作障礙是土壤肥力下降引起的[1，4-5，8-10，12]；現在越來越多的學者認為連作同一作物或同源作物會使特定的病原菌大量繁殖，導致土壤微生物群落及多樣性受到破壞，病原拮抗菌數量減少，微生物種類單一，對下茬作物造成危害[11-13]，而輪作可以斷絕病原菌的營養源從而減輕病害的發生，它能減緩連作障礙的發生。對于連作障礙的形成原因不同學者存在著不同的觀點。

岷歸（Angelica sinensis）又稱當歸，具有廣泛的藥用價值，是最常用的中藥，民間素有“十方九歸”之說[14]。岷縣當歸肉多枝少，氣味香醇，個頭整齊，無論是質量或數量，堪稱全國第一，當歸在甘肅省岷縣產量占全國總產量的70%。由鐮刀菌、腐霉菌和軟腐細菌侵染造成的當歸根腐病使幼苗猝倒、萎蔫、根腐，使成藥期和貯藏期根部水浸狀腐爛，嚴重影響了當歸的產量和質量，致使岷縣當歸藥材質量不穩定，嚴重影響了岷縣當歸在OTC市場發展中的地位，同時也影響了岷縣當歸在國內外的聲譽[15]。長期的農業實踐表明，當歸連作導致當歸根腐病害頻發，當歸生長受到嚴重影響，農業生產上采用“其他作物-當歸”輪作形式規避這一危害。加快解決這一問題成為提高當歸產量和質量的關鍵，然而關于當歸連作障礙的發生原因以及種植地土壤微生物的相關研究未見報道。本試驗以甘肅道地藥材岷歸為研究對象，采用大田試驗比較連作對當歸產量和品質的影響，揭示當歸連作障礙機制，并測定新墾荒的種植馬鈴薯田的土壤、當歸-馬鈴薯-當歸輪作和當歸-當歸連作土壤中當歸根腐病致病菌尖孢鐮刀菌（Fusarium oxysporum Schl.）的數量，并對其分離純化、培養和鑒定，為研究當歸連作障礙機制和提高當歸產量與品質提供理論與試驗依據。

1 材料與方法

1.1 大田試驗地氣候和理化性質

大田試驗地位于甘肅省岷縣十里鎮甘寨川當歸種植示范基地。試驗地海拔約2 200 m，年平均日照時間為2 214.9 h，年平均氣溫為5.7 ℃，絕對低溫為-26.3 ℃，無霜期為120 d，年平均水量在817.8 mm左右，5～9月為雨季，占年總量的79.4%。試驗地土壤理化性質：有機質含量為10.43 g/kg，總氮含量為1.82 g/kg，速效磷含量為10.47 mg/kg，速效鉀含量為30.09 mg/kg，離子交換量為6.97 cmol/kg，pH 6.86。

1.2 試驗材料

供試材料為當歸“90-02”，由中國科學院近代物理研究所和甘肅省定西市旱作農業中心聯合選育并提供。

1.3 大田試驗與產量測定

在岷縣種植當歸期間（7月上旬），在已經備好的試驗田起畦，畦長10 m，畦寬120 cm，畦高20 cm。在畦面上開設條溝，溝深約15 cm，溝寬約25 cm，將當歸種子放入條溝中，芽頭朝上，株距25 cm×25 cm，將開溝的泥土覆蓋前溝，再行排種，依此類推，種植用量為150 kg/hm2。種植前用農家肥作為底肥，每公頃施350 kg[15]。翌年3月中旬出苗后，正常田間管理。試驗處理組1：前茬種過當歸后種植一茬馬鈴薯再種植當歸的當歸-馬鈴薯-當歸輪作；試驗處理組2：前茬種植過當歸后，未經種植馬鈴薯而留待當歸種植時繼續種植當歸的當歸-當歸連作。每個處理組面積各約200 m2。采收時（10月28日）分別取輪作和連作100 cm×100 cm樣方測定產量，并分別計算各樣方根數。拷種后每個樣方選擇20根當歸測量其長度。每個處理用“五點采樣法”在四周和對角線交叉處共取5個樣方，每個指標測定重復5次。

1.4 當歸植株生長生理特性測定

大田種植60 d后，待當歸植株生長旺盛時，按照隨機原則剪取當歸植株頂部健康生長的第2、3片全展葉，帶回實驗室備用。用分光光度法測定葉綠素含量，用苯酚法測定可溶性糖含量，用標準曲線法測定游離脯氨酸的含量，用硫代巴比妥酸法測定丙二醛含量[16]；按照參考文獻[16，17]的方法，各取定量的當歸葉片加入少量的緩沖溶液，低溫研磨成勻漿，采用高速冷凍離心制得不同酶的粗提液，測定超氧化物歧化酶（SOD）、過氧化物酶（POD）和過氧化氫酶（CAT）活性。

1.5 致病菌的鑒定與根際土壤中致病菌數量的測定

選取發病植株并切取病株根莖木質部病健交界處，將組織切成0.5 cm×0.5 cm大小的薄片，先用流水清洗5～6次，用0.1% HgCl2消毒8 min后再將葉片分離出，用無菌去離子水清洗5～6次后，放入超凈工作臺備用。將滅菌的PDA培養基倒入培養皿內，然后在無菌條件下將患病組織1～2片貼在培養基中放入25 ℃光照培養箱中培養5 d，然后挑離培養的孢子純化菌種[18，19]。將致病菌在PDA培養基上培養5～7 d后，觀察菌落的外觀、形態、菌絲體的顏色以及菌株分泌的色素在培養基中的顏色，鑒定后培養備用。用抖根法[15]將當歸根際土壤和未種植過當歸的馬鈴薯根際土壤（作為對照，該馬鈴薯土壤與當歸根際土壤同質地）裝到無菌取樣袋中。所有土壤樣品立即帶回實驗室進行無菌培養和菌群落數目測定。

1.6 數據統計分析

所有數據用SPSS 17.0軟件統計分析。不同耕作處理下，當歸采收后的產量指標用單因素方差（One-way）分析進行顯著性檢驗（P<0.05或P<0.01）；土壤中的致病菌數量測定結果用單因素方差分析結合SSR多重比較統計分析。

2 結果與分析

2.1 連作對當歸產量的影響

由表1可知，當歸-當歸連作的當歸產量（根鮮重）明顯下降，與當歸-馬鈴薯-當歸輪作比較差異極顯著（P<0.01），當歸-馬鈴薯-當歸輪作產量為當歸-當歸連作的2.99倍。在連作條件下，當歸產后根鮮重和分根數都明顯下降，根也受到了生長抑制的影響，而當歸產量在連作和當歸-馬鈴薯-當歸輪作條件下相比較，當歸的分根數極顯著地降低（P<0.01），而根長則顯著減少（P<0.05）。輪作條件下的當歸分根數約為連作條件下的2倍，根長也比當歸連作條件下的長。

2.2 連作對當歸幼苗中葉綠素含量的影響

葉綠素是植物光合作用物質生產的主要元件，與植物生產關系密切。由表2可以看出，當歸輪作有助于提高幼苗植物的光合作用，提高光和效率，當歸連作下當歸幼苗葉片葉綠素a含量與當歸-馬鈴薯-當歸輪作相比極顯著降低（P<0.01），葉綠素b和類胡蘿卜素含量與當歸-馬鈴薯-當歸輪作相比顯著降低和升高（P<0.05），葉綠素a/葉綠素b與當歸-馬鈴薯-當歸輪作相比極顯著降低（P<0.01），葉綠素含量與當歸-馬鈴薯-當歸輪作相比極顯著降低（P<0.01）。

2.3 連作對當歸幼苗中可溶性糖、游離脯氨酸和丙二醛含量的影響

由表3可知，當歸連作下當歸幼苗中可溶性糖含量和丙二醛含量與當歸-馬鈴薯-當歸輪作相比都極顯著升高（P<0.01）；連作下當歸幼苗中游離脯氨酸含量與當歸-馬鈴薯-當歸輪作相比有顯著的升高（P<0.05）。結果表明，當歸連作后細胞膜脂質的過氧化程度增大，破壞了當歸幼苗細胞膜的通透性，引起主動抗逆的應答機制，增加了滲透調節物質可溶性糖、游離脯氨酸和丙二醛物質的積累。

2.4 連作對當歸幼苗SOD、POD和CAT的影響

由表4可知，不同耕作處理下當歸幼苗體內的3種酶活性都發生了很大的變化。當歸連作下幼苗葉片中SOD、POD和CAT活性與當歸-馬鈴薯-當歸輪作相比均極顯著地降低（P<0.01）。這可能與輪作后增加了微生物的多樣性，減少了致病菌對當歸幼苗的傷害有關。

2.5 當歸根腐病菌種的培養與初步鑒定

在PDA培養基上當歸根腐病菌菌落呈乳白色、白色，菌絲較短、短絨狀，氣生菌絲不發達，中間有明顯的隆起，菌落背面為淺黃色，由內向外逐漸變淡（圖1）。分生孢子梗螺旋式伸長、不分枝，較長；大型分生孢子兩端尖削或頂端尖，紡錘形至鐮刀形彎曲或端直，具2～5隔，多數為3隔，大小為5.0 μm×30.0～37.5 μm；小型分生孢子數量少，梭形至腎臟形，單胞，無隔膜，大小為4.5～5.0 μm×5.0～10.0 μm；后垣孢子頂生或間生，橢圓形或球形，平滑（圖2）。由此確定，該菌株為半知菌亞門絲孢綱瘤座孢目瘤座孢科鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）。

2.6 當歸根際土壤與對照土壤尖孢鐮刀菌數量比較

當歸連作根際土壤與馬鈴薯種植地對照土壤中尖孢鐮刀菌數量的比較結果見表5。經統計分析和SSR多重比較可知，當歸連作根際土壤與當歸-馬鈴薯-當歸輪作土壤中的尖孢鐮刀菌數量比對照土壤的數量都極顯著增加（P<0.01），而且當歸連作與當歸-馬鈴薯-當歸輪作的根際土壤尖孢鐮刀菌數量差異也呈極顯著差異（P<0.01），這種現象表明在種植馬鈴薯后，土壤中尖孢鐮刀菌數量是很少的，當種植當歸后，土壤中尖孢鐮刀菌數量增加明顯，且當歸連作下尖孢鐮刀菌數量也明顯增加。這說明，尖孢鐮刀菌是當歸生產中連作障礙的主要因素之一。

3 討論

當歸輪作與連作相比，輪作后產量提高，分根數也都有明顯的升高。連作下當歸幼苗中葉綠素和滲透調節物質可溶性糖、游離脯氨酸以及丙二醛的含量與輪作相比都受到了不同程度的影響；幼苗葉片中3種保護酶SOD、POD和CAT的活性都表現出顯著的降低。為了研究根部致病菌和根際土壤中主要存在的微生物，通過分離、純化、培養和鑒定后確定根部致病菌為半知菌亞門絲孢綱瘤座孢目瘤座孢科鐮刀菌屬的尖孢鐮刀菌（F. oxysporum）。

當歸連作根際土壤中尖孢鐮刀菌數量和當歸-馬鈴薯-當歸輪作中的數量比對照土壤中的數量極顯著增加，而且通過對不同耕種次序的土壤菌落進行培養研究得到了證實，這說明，是由于尖孢鐮刀菌引起連作障礙，影響了當歸的正常生長和降低了當歸的產量，尖孢鐮刀菌是當歸生產中連作障礙的主要因素之一。不同的耕作處理使當歸幼苗的生長發育和產量差距都很明顯，這是由于不同的耕作次序使得當歸土壤中致病菌的數量不同引起的，因為當歸根部的微生態系統是當歸-種植地土壤微生物-環境相互作用的復雜系統，如何處理3者之間的關系可能是解決當歸連作障礙問題的關鍵，在這個復雜的系統之中，當歸致病菌尖孢鐮刀菌扮演著重要的角色，連作后當歸根際尖孢鐮刀菌數量增多，感染當歸后所產生的次生代謝產物在當歸體內局部積累過多，破壞葉綠體結構而加速葉綠素分解，使葉綠素含量降低，影響到當歸植物幼苗光合作用，紊亂了正常的生理代謝過程，進而影響當歸根的生長和有機物質的積累，降低了當歸產量。植物在逆境時為了適應和對抗不利條件，體內會積累大量的可溶性糖、游離脯氨酸和丙二酮等滲透調節物質[16，20]。當歸連作后當歸幼苗體內調節物質明顯升高，這可能調節當歸幼苗細胞內的滲透壓，穩定細胞中酶分子的活性構象，保護酶免受直接的傷害，增強當歸的適應能力和生活力，而且連作還會降低當歸體內SOD、POD、CAT這3種酶的活性，破壞不同保護酶的平衡，引起當歸生理生化過程的紊亂，最終導致生長抑制；也可能是致病菌產生的孢子絲或者次生代謝產物與帶負電荷的當歸細胞中的核酸結合引起染色體畸變、降低DNA和RNA活性，干擾核酸代謝[16]，最終導致的當歸產量和品質的下降。這些不利于當歸生長和發育的生理變化都與尖孢鐮刀菌的數量和所產生的次生代謝產物有著緊密的關聯，所以尖孢鐮刀菌是當歸生產中連作障礙的主要因素之一。而當歸連作障礙的原因是一個非常復雜的生物學和農學問題，要徹底解決和弄清楚其機理有待更加深入的研究。

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