稻草秸稈預處理方法對綠色木霉產纖維素酶的研究

孫憲迅+孫憲猛+韓雪+孫齊英

摘要：以稻草秸稈為原料，采用不同質量分數的磷酸、氨水、磷酸與氨水聯合浸泡處理等方法對稻草桔稈進行預處理，預處理后稻草用于纖維素酶固態發酵。以羧甲基纖維素酶（CMC）酶活和濾紙酶（FPA）酶活為指標，比較不同預處理方法對綠色木霉（Trichoderma viride）固態發酵產纖維素酶的影響。研究結果表明，磷酸與氨水聯合預處理秸稈最有利于綠色木霉固態發酵產纖維素酶，羧甲基纖維素酶（CMC）酶活和濾紙酶（FPA）酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。

關鍵詞：稻草秸稈；綠色木霉（Trichoderma viride）；固態發酵；纖維素酶

中圖分類號：TS254.9 文獻標識碼：A 文章編號：0439-8114（2014）18-4387-03

近年來，由于化石能源枯竭和大量使用帶來的溫室效應，可再生資源的開發利用日益受到人們重視[1，2]。稻草是一種非常豐富的可再生能源，利用稻草秸稈生產纖維素酶，對纖維乙醇的生產有重要的現實意義[3，4]。稻草秸稈主要由纖維素、半纖維素和木質素組成，其中木質素的包覆作用及纖維素結晶致密結構使各種菌株產酶活力低，成本高。采用物理、化學和生物方法對稻草進行預處理，盡量除去木質素，破壞纖維素的晶體結構，提高纖維素酶的活力[5]。通常的預處理方法往往以預處理產糖或者后續酶解率為考核指標，而預處理方法對微生物利用產酶的研究報道很少[6-11]。本研究以綠色木霉（Trichoderma viride）為出發菌株，研究幾種稻草預處理方法對菌株產纖維素酶效果的影響進行了比較。

1 材料與方法

1.1 材料

菌種為綠色木霉，實驗室保藏；稻草秸稈取自武漢漢陽郊區。

1.2 培養基

種子培養基為PDA培養基；發酵培養基[12]：稻草∶麩皮=3∶2，固液比為1∶2，Mandrels溶液與固體比=2∶1；Mandrels營養液：KH2PO4 2 g，（NH4）2SO4 1.4 g，尿素0.3 g，MgSO4 7H2O 0.3 g，CaCl2 0.3 g，FeSO4 7H2O 5 mg，MnSO4 H2O 1.56 mg，ZnSO4 1.4 mg，CoCl2 0.2 mg，水1 L。

1.3 試驗方法

1.3.1 木霉發酵產酶及測試[13] 在250 mL三角瓶中裝入5%固體培養基（稻草15 g，麩皮10 g，Mandrels溶液50 mL）按2%接入種子液，于37 ℃發酵72 h，每隔12 h搖勻一次固體培養基，發酵結束后，室溫自然風干即為纖維素酶干曲。粗酶液的制備：取纖維素酶干曲5 g加200 mL去離子水溶解，紗布過濾后3 000 r/min離心，再適當稀釋即為待測酶液。

1.3.2 酶活測定 羧甲基纖維素鈉酶活（CMC）單位定義：在40 ℃ pH 4.8條件下，每l g纖維素酶干曲在1 min內水解CMC生成l μmol葡萄糖的酶量，為一個纖維素酶（CMC酶）活力單位（以U表示）； 濾紙酶活（FPA）單位定義：在40 ℃ pH 4.8條件下，每 l g纖維素酶干曲在l h內水解新華濾紙，生成l μmol葡萄糖的酶量，為一個纖維素酶濾紙酶活單位（以U表示）。

1）羧甲基纖維素鈉酶活（CMC）測定。吸取0.5 mL粗酶稀釋液于試管中，加入1.5 mL 1%CMC-檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.8），于40 ℃水浴反應30 min，立即加入2.5 mL DNS煮沸滅活，測定還原糖含量。

2）濾紙酶活（FPA）測定。吸取0.5 mL粗酶稀釋液于試管中，加入1.5 mL檸檬酸緩沖液（0.1 mol/L，pH 4.8），混勻后將1條1 cm×6 cm的濾紙條卷成小卷放入其中，于40 ℃水浴反應60 min，立即加入2.5 mL DNS煮沸滅活，測定還原糖含量。

1.3.3 試驗設計

1）稻草粉碎度對綠色木霉發酵的影響。稻草先剪成5 cm左右，再用氣流式超微高速粉碎機粉碎后，分別用100、80、60、40、20目的篩子過篩分級，各稱取適量稻草粉作為惟一碳源，配置培養基，比較不同粉碎度對綠色木霉固態發酵產纖維素酶的影響。

2）濃磷酸預處理對綠色木霉發酵的影響。將稻草秸稈粉碎，過60目篩，按稻草與不同質量分數的濃磷酸按固液比（m/V，g∶mL，下同）1∶8在50 ℃處理時間1.0 h，預處理結束后，過濾，濾餅烘干至恒重備用。稱取適量預處理后稻草粉作為惟一碳源，配置培養基，比較不同質量分數濃磷酸預處理對綠色木霉產纖維素酶固態發酵的影響，以不處理的為對照（CK）。

3）氨水預處理對綠色木霉發酵的影響。將稻草秸稈粉碎，過60目篩，稻草與不同濃度氨水按固液比1∶8室溫下預處理35 h，過濾，濾餅烘干至恒重備用。稱取適量預處理后稻草粉作為惟一碳源，配置培養基，比較不同濃度氨水預處理對綠色木霉產纖維素酶固態發酵的影響，以不處理的為對照（CK）。

4）氨水與濃磷酸結合預處理。①將過60目篩的稻草秸稈粉末，先用15%氨水按固液比1∶6室溫下浸泡20 h，過濾，風干；再用40%濃磷酸按1∶10，溫度50 ℃處理時間30 min，過濾，濾餅烘干至恒重備用；②將過60目篩的稻草秸稈粉末，先用40%濃磷酸按固液比1∶10，溫度50 ℃處理時間30 min，過濾，風干；再用15%氨水按固液比1∶6，室溫下浸泡20 h，過濾，濾餅烘干至恒重備用，后續酶活測定同氨水處理。

2 結果與分析

2.1 稻草粉碎度對綠色木霉產酶的影響

不同粉碎度的稻草粉作為碳源，綠色木霉表現出不同的產纖維素酶能力（表1）。由表1可以看出，稻草秸稈粉碎后的CMC酶活和濾紙酶活比未處理的對照都高，而且隨著粉碎度的增加，產酶能力逐漸提高。從20目升高到60目時，酶活升高較快。當粉碎度達到60目時，產酶能力較高。當從60目升高到100目時，產酶增加不多。目數越大，預處理成本越大。從節約成本和能源的角度考慮，以選擇粉碎度60目為宜。

2.2 磷酸預處理對綠色木霉產酶的影響

以對照組的CMC酶和FPA酶活為100%，計算采用不同質量分數磷酸預處理后各組的相對酶活（表2）。磷酸預處理后的稻草粉過濾烘干直接作為綠色木霉的碳源進行纖維素酶發酵，所產的酶活比未處理的對照都低。磷酸預處理稻草粉可以裂解木質素的結構，降解部分半纖維素，破壞纖維素的晶體結構。稻草經磷酸預處理產生呋喃、酚醛以及其他有機酸等物質，而其中一些物質不但對微生物生長具有抑制作用，而且不利于菌株的產酶。磷酸是不揮發性酸，殘留的磷酸抑制菌株的生長與產酶。磷酸預處理后的稻草烘干直接發酵CMC酶活和FPA酶活明顯降低。

2.3 氨水預處理對綠色木霉產酶的影響

以對照組的CMC酶和濾紙酶活為100%，計算采用不同濃度氨水預浸泡的各組的相對酶活（表3）。氨水預處理后的稻草粉過濾烘干直接作為綠色木霉的碳源進行纖維素酶發酵，所產的酶活比對照未處理的都低。氨水主要是破壞稻草粉的木質素的結構，降解部分半纖維素。殘留的木質素小分子物質對纖維素酶活有影響，故所測的纖維素酶活較低。殘余的氨水易揮發，又能被綠色木霉當氮源加以利用，纖維素被氨水浸泡預處理后直接發酵產纖維素酶比磷酸預處理效果好。

2.4 磷酸氨水聯合預處理結果

稻草粉先用15%氨水浸泡，再用濃磷酸預處理，過濾、烘干的稻草粉作為綠色木霉的碳源進行纖維素酶發酵，所測的CMC酶活和FPA酶活與對照的比較，都明顯降低，但比單獨的磷酸處理降低要少。這與氨水浸泡帶走部分木質素，后用磷酸處理產生的副產物較少有關，主要是殘留的磷酸對綠色木霉產酶影響。稻草粉先用磷酸處理，再用氨水浸泡，過濾、烘干的稻草粉作為綠色木霉的碳源進行纖維素酶發酵，所測的CMC酶活和濾紙酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。其原因可能是磷酸預處理破壞大部分木質素，纖維素的晶體結構被破壞。在此過程中產生的一些副產物如呋喃、酚醛以及其他有機酸等，被后續的氨水稀釋帶走。磷酸處理中殘留的磷酸被氨水中和，被帶走或者生成磷酸鹽被微生物吸收利用。氨水在后處理過程中，對木質素也有部分溶解作用，使稻草中的木質素處理更加完全。而氨水易揮發殘留少，即使在稻草中也能被微生物作為氮源吸收利用，所產生的CMC酶活和FPA酶活明顯提高。

3 小結與討論

粉碎度對綠色木霉利用稻草作為惟一的碳源產纖維素酶有幫助。粉碎度越大，同樣條件下產纖維素酶酶活越高，考慮到生產成本，粉碎到60目就滿足工藝條件。取機械粉碎后的稻草過60目篩，先用40%的磷酸預處理，過濾晾干后再用10%的氨水浸泡，預處理的稻草粉纖維素酶發酵，所測的CMC酶活和濾紙酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。

目前采用酸堿預處理木質纖維素原料是常用的方法，但是原料預處理后，須用大量的水進行洗滌和脫毒處理。既產生大量的廢水，污染環境，又會去除部分營養成分，導致必要營養素缺乏，需要在后續工藝中添加。采用先磷酸處理后氨水浸泡的方法，不需要進行洗滌和脫毒處理，微生物能利用生產纖維素酶。本工藝首先利用磷酸部分脫除稻草粉中木質素和破壞纖維素的晶體結構，再用氨水浸泡，氨水既中和殘留的磷酸，又部分去除木質素，使得微生物能利用纖維素產酶。操作在常溫常壓下進行，對設備要求和節能方面具有優勢，采用本工藝可以降低生產成本和能耗。

參考文獻：

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[12] 邱雁臨，孫憲迅，曾 瑩.發酵秸稈生產纖維素酶工藝條件的研究[J].糧油食品科技，2004，12（4）：4-6.

[13] 邱雁臨，孫憲迅，蔡 俊，等.纖維素酶耐高溫高產菌株的選育[J].中國釀造，2004（2）：15-19.

2.2 磷酸預處理對綠色木霉產酶的影響

以對照組的CMC酶和FPA酶活為100%，計算采用不同質量分數磷酸預處理后各組的相對酶活（表2）。磷酸預處理后的稻草粉過濾烘干直接作為綠色木霉的碳源進行纖維素酶發酵，所產的酶活比未處理的對照都低。磷酸預處理稻草粉可以裂解木質素的結構，降解部分半纖維素，破壞纖維素的晶體結構。稻草經磷酸預處理產生呋喃、酚醛以及其他有機酸等物質，而其中一些物質不但對微生物生長具有抑制作用，而且不利于菌株的產酶。磷酸是不揮發性酸，殘留的磷酸抑制菌株的生長與產酶。磷酸預處理后的稻草烘干直接發酵CMC酶活和FPA酶活明顯降低。

2.3 氨水預處理對綠色木霉產酶的影響

以對照組的CMC酶和濾紙酶活為100%，計算采用不同濃度氨水預浸泡的各組的相對酶活（表3）。氨水預處理后的稻草粉過濾烘干直接作為綠色木霉的碳源進行纖維素酶發酵，所產的酶活比對照未處理的都低。氨水主要是破壞稻草粉的木質素的結構，降解部分半纖維素。殘留的木質素小分子物質對纖維素酶活有影響，故所測的纖維素酶活較低。殘余的氨水易揮發，又能被綠色木霉當氮源加以利用，纖維素被氨水浸泡預處理后直接發酵產纖維素酶比磷酸預處理效果好。

2.4 磷酸氨水聯合預處理結果

稻草粉先用15%氨水浸泡，再用濃磷酸預處理，過濾、烘干的稻草粉作為綠色木霉的碳源進行纖維素酶發酵，所測的CMC酶活和FPA酶活與對照的比較，都明顯降低，但比單獨的磷酸處理降低要少。這與氨水浸泡帶走部分木質素，后用磷酸處理產生的副產物較少有關，主要是殘留的磷酸對綠色木霉產酶影響。稻草粉先用磷酸處理，再用氨水浸泡，過濾、烘干的稻草粉作為綠色木霉的碳源進行纖維素酶發酵，所測的CMC酶活和濾紙酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。其原因可能是磷酸預處理破壞大部分木質素，纖維素的晶體結構被破壞。在此過程中產生的一些副產物如呋喃、酚醛以及其他有機酸等，被后續的氨水稀釋帶走。磷酸處理中殘留的磷酸被氨水中和，被帶走或者生成磷酸鹽被微生物吸收利用。氨水在后處理過程中，對木質素也有部分溶解作用，使稻草中的木質素處理更加完全。而氨水易揮發殘留少，即使在稻草中也能被微生物作為氮源吸收利用，所產生的CMC酶活和FPA酶活明顯提高。

3 小結與討論

粉碎度對綠色木霉利用稻草作為惟一的碳源產纖維素酶有幫助。粉碎度越大，同樣條件下產纖維素酶酶活越高，考慮到生產成本，粉碎到60目就滿足工藝條件。取機械粉碎后的稻草過60目篩，先用40%的磷酸預處理，過濾晾干后再用10%的氨水浸泡，預處理的稻草粉纖維素酶發酵，所測的CMC酶活和濾紙酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。

目前采用酸堿預處理木質纖維素原料是常用的方法，但是原料預處理后，須用大量的水進行洗滌和脫毒處理。既產生大量的廢水，污染環境，又會去除部分營養成分，導致必要營養素缺乏，需要在后續工藝中添加。采用先磷酸處理后氨水浸泡的方法，不需要進行洗滌和脫毒處理，微生物能利用生產纖維素酶。本工藝首先利用磷酸部分脫除稻草粉中木質素和破壞纖維素的晶體結構，再用氨水浸泡，氨水既中和殘留的磷酸，又部分去除木質素，使得微生物能利用纖維素產酶。操作在常溫常壓下進行，對設備要求和節能方面具有優勢，采用本工藝可以降低生產成本和能耗。

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2.2 磷酸預處理對綠色木霉產酶的影響

以對照組的CMC酶和FPA酶活為100%，計算采用不同質量分數磷酸預處理后各組的相對酶活（表2）。磷酸預處理后的稻草粉過濾烘干直接作為綠色木霉的碳源進行纖維素酶發酵，所產的酶活比未處理的對照都低。磷酸預處理稻草粉可以裂解木質素的結構，降解部分半纖維素，破壞纖維素的晶體結構。稻草經磷酸預處理產生呋喃、酚醛以及其他有機酸等物質，而其中一些物質不但對微生物生長具有抑制作用，而且不利于菌株的產酶。磷酸是不揮發性酸，殘留的磷酸抑制菌株的生長與產酶。磷酸預處理后的稻草烘干直接發酵CMC酶活和FPA酶活明顯降低。

2.3 氨水預處理對綠色木霉產酶的影響

以對照組的CMC酶和濾紙酶活為100%，計算采用不同濃度氨水預浸泡的各組的相對酶活（表3）。氨水預處理后的稻草粉過濾烘干直接作為綠色木霉的碳源進行纖維素酶發酵，所產的酶活比對照未處理的都低。氨水主要是破壞稻草粉的木質素的結構，降解部分半纖維素。殘留的木質素小分子物質對纖維素酶活有影響，故所測的纖維素酶活較低。殘余的氨水易揮發，又能被綠色木霉當氮源加以利用，纖維素被氨水浸泡預處理后直接發酵產纖維素酶比磷酸預處理效果好。

2.4 磷酸氨水聯合預處理結果

稻草粉先用15%氨水浸泡，再用濃磷酸預處理，過濾、烘干的稻草粉作為綠色木霉的碳源進行纖維素酶發酵，所測的CMC酶活和FPA酶活與對照的比較，都明顯降低，但比單獨的磷酸處理降低要少。這與氨水浸泡帶走部分木質素，后用磷酸處理產生的副產物較少有關，主要是殘留的磷酸對綠色木霉產酶影響。稻草粉先用磷酸處理，再用氨水浸泡，過濾、烘干的稻草粉作為綠色木霉的碳源進行纖維素酶發酵，所測的CMC酶活和濾紙酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。其原因可能是磷酸預處理破壞大部分木質素，纖維素的晶體結構被破壞。在此過程中產生的一些副產物如呋喃、酚醛以及其他有機酸等，被后續的氨水稀釋帶走。磷酸處理中殘留的磷酸被氨水中和，被帶走或者生成磷酸鹽被微生物吸收利用。氨水在后處理過程中，對木質素也有部分溶解作用，使稻草中的木質素處理更加完全。而氨水易揮發殘留少，即使在稻草中也能被微生物作為氮源吸收利用，所產生的CMC酶活和FPA酶活明顯提高。

3 小結與討論

粉碎度對綠色木霉利用稻草作為惟一的碳源產纖維素酶有幫助。粉碎度越大，同樣條件下產纖維素酶酶活越高，考慮到生產成本，粉碎到60目就滿足工藝條件。取機械粉碎后的稻草過60目篩，先用40%的磷酸預處理，過濾晾干后再用10%的氨水浸泡，預處理的稻草粉纖維素酶發酵，所測的CMC酶活和濾紙酶活分別是未處理的283.25%和174.38%。

目前采用酸堿預處理木質纖維素原料是常用的方法，但是原料預處理后，須用大量的水進行洗滌和脫毒處理。既產生大量的廢水，污染環境，又會去除部分營養成分，導致必要營養素缺乏，需要在后續工藝中添加。采用先磷酸處理后氨水浸泡的方法，不需要進行洗滌和脫毒處理，微生物能利用生產纖維素酶。本工藝首先利用磷酸部分脫除稻草粉中木質素和破壞纖維素的晶體結構，再用氨水浸泡，氨水既中和殘留的磷酸，又部分去除木質素，使得微生物能利用纖維素產酶。操作在常溫常壓下進行，對設備要求和節能方面具有優勢，采用本工藝可以降低生產成本和能耗。

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