耐高糖酵母的篩選鑒定及其產多元醇分析*

齊向輝，王旭，林靜，朱婧斐，羅艷，孫文敬

(江蘇大學食品與生物工程學院，江蘇鎮江，212013)

耐高滲酵母是一類能夠在自然或人為高滲透壓環境下正常生長繁殖的微生物，分為耐糖酵母和耐鹽酵母。近年來，微生物相關研究領域已逐漸轉向極端微生物，其中耐高糖酵母已經引起了人們的熱切關注。起初，耐高糖酵母的存在僅僅被作為引起高糖食品腐敗的標志，后來Spencer［1］等人發現:在好氧條件下，耐高滲酵母發酵糖類物質能夠產生多種多元醇。隨后，各國研究者開始了對耐高糖酵母的深入研究，主要包括該類菌的好氧發酵和代謝機理。較不耐高滲酵母而言，耐高滲酵母具有活躍的HMP代謝途徑，能夠通過胞內累積相容性物質來適應不同程度的高滲環境［2］。研究發現，酵母的耐高滲生長能力與其產多元醇的類別之間存在一定的關聯［3］，據此可以依據所需目標發酵產物設置不同的發酵環境。另外，在食品工業和生物工程方面，耐高滲酵母的應用愈加廣泛:(1)在高滲環境中，耐高滲酵母能夠產生D-阿拉伯糖醇，或赤蘚糖醇［4］等功能性多元醇物質［5］。Onishi［6］等人報道了從葡萄糖到木糖醇的三步微生物發酵法，其中D-阿拉伯糖醇是關鍵中間產物，并提出以葡萄糖為發酵底物生產 D-阿拉伯醇是可行的。自此，生物發酵法生產 D-阿拉伯醇受到國內外學者的廣泛關注，并進行了諸多相關研究。(2)由于很多種屬的酵母都能在高滲環境下胞內累積甘油，所以耐高滲酵母也可以作為生產甘油的優良工程菌［7］。(3)選擇耐高滲酵母作為生產菌株，可以很好的抑制生產過程中的雜菌污染。(4)固定化耐高滲酵母可以生產乙醇，目前利用此法生產乙醇的效率已經有了很大的提高。菌種是發酵工程的靈魂，鑒于耐高滲酵母所產多元醇多數為功能性糖醇，也可將此類酵母稱為功能性微生物。

本文通過對采自天然高糖環境的樣品進行高糖(40%)富集培養，從中篩選到了99株耐高糖酵母菌株，并對隨機挑選的40株(源自不同花蜜樣品)實驗菌株發酵葡萄糖產生多元醇的種類進行了初步分析，其中分離到的產D-阿拉伯糖醇和甘油的酵母居多。最后，根據形態學觀察、生理生化實驗及ITS序列測定對不同典型菌落的酵母菌株進行了鑒定。

1 材料與方法

1.1 材料

天然蜂蜜樣品，樣品A:棗花蜜;樣品B:油菜花蜜;樣品C:荊條花蜜;樣品D:野百花蜜。其中樣品A，B，C采自江蘇省鎮江市養蜂園。樣品D采自湖北房縣荒山上的天然蜂巢。

富集篩選培養基(g/L):400葡萄糖，10酵母粉，10胰蛋白胨(平板培養基另加20瓊脂粉);保藏培養基(g/L):50葡萄糖，10酵母粉，10胰蛋白胨，20瓊脂粉;YPD培養基(g/L):10酵母粉，10胰蛋白胨，20葡萄糖;發酵培養基(g/L):200葡萄糖，10酵母粉，10胰蛋白胨。

1.2 方法

1.2.1 耐高滲酵母的分離與篩選

將不同蜂蜜樣品分別稱取1.0 g，加入到含有20 mL富集培養基的250 mL三角瓶中，渦旋均勻后，30℃，200 r/min，搖瓶培養3 d。將富集培養物梯度稀釋后，分別吸取200 μL涂布到含富集培養基的培養皿中，于30℃培養箱中培養，挑選生長良好的單菌落劃線分離純化，斜面保存于4℃冰箱。

1.2.2 耐高滲酵母產多元醇的種類分析

各自挑選10株源自不同花蜜樣品的耐高糖酵母，將其分別接種于含有20 mL發酵培養基的250 mL三角瓶中，30℃，200 r/min，搖瓶培養3 d。通過薄層層析法對發酵液中的多元醇產物進行初步定性和粗定量檢測。根據葡萄糖和D-阿拉伯糖醇的Rf值和分離效果，分析普通硅膠玻璃板、鋁制硅膠板和微晶纖維素板的層析情況，優化并確認層析板規格和層析條件。樣品處理方法如下:取不同菌株的發酵液各1 mL，10 000 r/min離心10 min，取1 μL上清點樣于微晶纖維素板上，層析時間為80 min，重復層析3～4次，層析結束后自然晾干，層析圖譜的顯色采用飽和硝酸銀-丙酮和氫氧化鈉-乙醇溶液，具體可參照文獻［8］。

1.2.3 酵母菌株的鑒定

1.2.3.1 菌落形態及生理生化特征

從篩選到的菌株中挑選不同形態的典型單菌落，分別轉接于YPD液體培養基中，搖瓶培養，在40倍顯微鏡下觀察不同時期菌體細胞的形態特征。實驗菌株的菌落形態及生理生化特征鑒定方法參照文獻［9］。

1.2.3.2 耐高滲酵母的分子特征

挑取選出的不同形態的典型單菌落于1 mL無菌水中，采用反復凍融法使細胞破壁，從而提取酵母菌的DNA，并以此作為PCR模板。采用真菌的通用引物，ITS1:5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’，ITS4:5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’。PCR 程序條件為:95℃預變性5 min，94℃變性1 min，54℃退火1 min，72℃延伸40s，反應32個循環，最后72℃延伸10 min。PCR擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳檢測后送測，測序工作由南京金斯瑞生物有限公司完成。在NCBI核酸序列數據庫中通過BLAST進行同源序列對比，選擇相似性在98%以上酵母菌菌株的相關序列進行分析，利用MEGA 4.1軟件，采用 Neighbor-Joining法進行分子系統學分析，構建系統發育樹，分析所篩菌株與已知酵母菌的親緣關系。

1.2.4 氣相色譜法測定D-阿拉伯糖醇產量

根據層析圖譜分析，初步篩選葡萄糖殘量低且D-阿拉伯糖醇產量相對較高的菌株，將其轉接至發酵培養基中進行搖瓶培養，培養條件為:30℃，200 r/min，搖瓶振蕩培養96 h。隨后將不同菌株的發酵液離心取上清分別傾倒入培養皿中置于－80℃冰箱冷凍3 h，再置于冷凍干燥機冷凍48 h，之后對發酵液中的固形物進行糖精乙酸酯衍生化，具體方法如下:稱取菌株的發酵固形物100.0 mg于不同的Ep管(2 mL)中，各自加入10.0 mg鹽酸羥胺和1.0 mL吡啶，90℃水浴反應30 min，取出冷卻至室溫，再各自加入1.0 mL乙酸酐，90℃水浴反應30 min，取出冷卻至室溫，再經氯仿萃取出有機相，待進樣。選用Sigma公司的D-阿拉伯糖醇作為標樣，梯度(10.0～60.0 mg)稀釋測樣，繪制標準曲線，其糖精乙酸酯衍生物的制備方法同上。氣相色譜分析條件:色譜柱Agilent HP－5(30 m×0.25 mm ×1 μm);柱溫:起始溫度180 ℃，保持30 min，10℃/min升溫至280℃，保持2 min;進樣口:200℃;檢測器:FID，溫度:250℃;載氣:高純氮氣，流速20 mL/min;氫氣流速30 mL/min，空氣流速300 mL/min，分流比:50∶1;進樣量1 μL。

2 結果

2.1 耐高滲酵母的分離篩選

經過葡萄糖含量為400 g/L的高糖培養基富集培養，從不同來源的天然蜂蜜樣品中分離出99株生長良好的耐高滲酵母菌株。經形態學初步鑒定，發現這些菌株可歸為3種菌落形態，菌落一較大，偏黃，半透明，光滑濕潤，色澤均一;菌落二較小，凸起，奶油色，不透明，光滑;菌落三為白色，不光滑，表面略有褶皺。其中，來自棗花蜜、油菜花蜜和荊條花蜜的酵母菌落形態單一，而來自野百花蜜中的酵母菌落呈現以上3種形態，具有一定的酵母多樣性。

2.2 耐高滲酵母發酵葡萄糖產多元醇的初步分析

在層析板規格的選擇方面，實驗結果表明:微晶纖維素板對于多元醇類物質具有最好的分離效果，確立了一種以微晶纖維素板為層析介質，可用于對發酵液成分進行初步定性和粗定量檢測分析的薄層層析方法。在層析展開劑選擇及優化方面，經過多種羥基類有機溶劑的不同比例配比，結合分離度和Rf值情況，試驗最終選用展開劑及其配比為:乙酸乙酯∶吡啶∶冰乙酸∶水 =16∶10∶2∶3，重復層析 3～4 次，層析效果比較好(部分層析圖譜見圖1)。在確定了層析條件的基礎上，從分離得到的99株源自不同花蜜樣品的菌株中隨機挑選40株(具有3種不同菌落形態)耐高滲酵母，進行搖瓶實驗。采用優化的層析條件對發酵液進行層析試驗和圖譜分析。

圖1 發酵液中多元醇的TLC結果(部分圖譜)Fig.1 The analysis result of fermentation broth by TLC

由圖1可以明顯看到，葡萄糖、D-阿拉伯糖醇、赤蘚糖醇和甘油的遷移率Rf值相差明顯，在此層析條件下，可將底物葡萄糖和產物D-阿拉伯糖醇兩者分離開來，該層析方法完全可以用于D-阿拉伯糖醇產生菌初篩過程中糖醇類產物的定性檢測。自不同樣品中分離的耐高滲酵母產多元醇的結果歸納如表1所示。

由表1可知，源自花蜜樣品的酵母屬產醇類別比較單一。在所分離到的耐高滲酵母中，產甘油的菌株來自不同花蜜樣品;產赤蘚糖醇的菌株大多數來自野百花蜜樣品;產D-阿拉伯糖醇的菌株大部分是自荊條花蜜樣品中分離而來。

表1 來自不同花蜜樣品的耐高滲酵母搖瓶發酵產多元醇的情況Table 1 The variety of polyol in the fermentation broth by flask-shaking of 40 strains isolated from different samples

2.3 菌株的鑒定

2.3.1 酵母菌的形態學和生理生化特征

由于篩選到的產多元醇耐高滲酵母在平板上明顯分布3種形態的菌落，并結合TLC篩選的圖譜情況，各挑選1個典型特征的酵母單菌落，將其命名為JM-1，JM-2，JM-3。所選3株酵母菌落和細胞主要形態特征如圖2和圖3所示，發酵糖類和同化碳氮源的鑒定結果如表2所示。由這些圖表可知，菌株JM-1，JM-2，JM-3在G1固體培養基上，30℃培養3 d后菌落特征雖然各有差異，但它們均有酵母菌的一些共有特征，如:菌落均為圓形，邊緣整齊，中間凸起，較黏稠，易挑起，色澤均一;借助光學顯微鏡進一步觀察菌株JM-1，JM-2，JM-3在G1液體培養基中生長的細胞特征發現:菌體細胞呈圓形或橢圓形，出芽生殖，生長到穩定期時出現類似于液泡組織，體積變大，具有典型的酵母菌細胞特征。

圖2 平板上3種不同的典型菌落形態Fig.2 Three typical colony morphology of strain JM-1，JM-2，JM-3

表2 發酵糖類及同化碳氮源等生理生化鑒定結果Table 2 The results of carbohydrate fermentation and assimilation carbon and nitrogen source

圖3 菌株JM-1，JM-2，JM-3在G1液體培養基中搖床培養16h的細胞形態Fig.3 The cellular morphology of strain JM-1，JM-2，JM-3

2.3.2 耐高滲酵母的分子生物學特征鑒定

真菌ITS區域核酸序列的相似性，已經成為公認的確定酵母菌分類地位的重要分子生物學依據。本實驗以反復凍融法提取的酵母DNA為模板，以真菌通用引物ITS1和ITS4為引物，通過PCR擴增出的片段經瓊脂糖凝膠電泳，結果如圖4所示。

克隆所得到的菌株JM-1，JM-2，JM-3的ITS序列長度分別約為500、700、350bp，測序后確定長度分別為510，683，365bp，與電泳圖譜一致，試驗結果可信。經NCBI中BLAST序列比對，根據同源序列搜索結果，選擇相似性在98%以上的酵母菌菌株的相關序列進行分析。得到結果為:JM-1號菌株與Lodderomyces elongisporus的遺傳距離最近，且核苷酸序列相似性高達 100%，JM-2號菌株與 Zygosaccharomyces rouxii的遺傳距離最近，核苷酸序列相似性高達100%，JM-3號菌株與Starmerella sp.序列相似性達到99%。菌株JM-1，JM-2，JM-3的系統發育樹構建如圖5所示，可以清楚顯示出實驗菌株與NCBI中一些參考酵母菌株的親緣關系。綜合菌落外觀形態，細胞形態，生理生化實驗 (與文獻［9］中相應酵母菌屬的描述一致)及其分子生物學特征均表明，測序菌株JM-1，JM-2，JM-3的分類地位分別屬于Lodde1romyces elongisporus，Zygosaccharomyces rouxii，Starmerella sp.。

圖4 典型酵母菌株JM-1，JM-2，JM-3的 PCR產物Fig.4 PCR products of three strains

圖5 菌株JM-1，JM-2，JM-3同源樹的構建Fig.5 Phylogenetic tree of strain JM-1，strain JM-2 and strain JM-3

2.4 產D-阿拉伯糖醇菌株產量的測定

根據層析圖譜結果，本實驗篩選出1株葡萄糖殘量低且D-阿拉伯糖醇產率相對較高的菌株Z.rouxii JM-12，將該菌株作為發酵出發菌株，利用氣相色譜法對D-阿拉伯糖醇產量進行初步定量。以D-阿拉伯糖醇標品進樣量(mg)為橫坐標，峰面積(A)為縱坐標，繪制標準曲線，得到回歸方程:y=115 584x+96.877，R2=0.999 3，表明 D-阿拉伯糖醇在 10～60 mg范圍內與峰面積的比值呈良好的線性關系。并且精密度試驗結果RSD=1.59%(n=3)，重復性試驗結果RSD=0.63%(n=3)，表明所用儀器精密度和重現性均良好。

圖6-A給出了D-阿拉伯糖醇和D-葡萄糖的混合標品的糖精乙酸酯衍生物的色譜圖，其中D-阿拉伯糖醇的出峰時間為4.236 min，D-葡萄糖的出峰時間為5.124 min。菌株Z.rouxii JM-12的發酵液樣品經過處理在同樣的色譜分析條件下進樣，得到的圖譜如圖6-B所示，根據相同的保留時間可知:發酵產物D-阿拉伯糖醇衍生物的峰面積為4 191.3，帶入回歸方程可得到D-阿拉伯糖醇的進樣量為35.4 mg，經換算后可得菌株Z.rouxii JM-12轉化200 g/L D-葡萄糖得到D-阿拉伯糖醇的產量為(61.33+0.49)g/L，即0.31 g/g D-葡萄糖。

3 討論與結論

本試驗建立了一種簡單的分離耐高滲酵母的方法，即直接從天然高糖環境取樣，經高糖富集培養，涂布高糖培養基篩選分離出多株耐高滲酵母，表現為3種菌落形態特征，經ITS序列鑒定，結果分別屬于Lodderomyces elongisporus，Zygosaccharomyces rouxii，Starmerella sp.。有研究表明［10］，真菌的 ITS 序列在研究關系相近的屬間和種間的區別中十分有價值，如今的真菌系統發育和分類方法已經普遍以ITS序列間的差異為理論基礎，采用多聚酶鏈式反應(PCR)技術實現，同時，對ITS序列進行的深入分析對于相關分子生物學的發展起到一定的推動作用。

圖6 氣相色譜圖Fig.6 Result of gas chromatography

通過實驗菌株發酵葡萄糖的試驗，得到多株產D-阿拉伯糖醇的酵母。在此試驗過程中，大多數發酵液底物和羥基類產物比較容易分離，然而葡萄糖和D-阿拉伯糖醇的結構和物理特性比較相似，較難分離開來，所以本實驗以葡萄糖和D-阿拉伯糖醇的Rf值之比作為分離效果的參考標準，根據二者的物理相似相容性，設計了多種羥基類有機溶劑的不同比例配比的組合層析劑，并最終確立了一種簡單有效的可初步用于篩選D-阿拉伯糖醇產生菌的定性和粗定量檢測的層析方法。

鑒于D-阿拉伯糖醇重要的應用價值和需求潛力以及當前制備的高成本，尋求發酵性能優良的生產菌株是研究高效工業生產的前提。Badal［11］等人已經報道過魯氏接合酵母屬產D-阿拉伯糖醇的相關研究，并且D-拉伯糖醇的產率能夠達到0.48 g/g葡萄糖，深化了從自然高糖環境篩選產D-阿拉伯糖醇耐高滲酵母的意義。本研究也篩選出了1株性能優良的菌株 Z.rouxii JM-12，其 D-阿拉伯糖醇產量可達61.3 g/L，即0.31 g/g葡萄糖，具有一定的開發應用價值。據此，作者將通過進一步篩選和優化發酵條件，希望得到1株高產D-阿拉伯糖醇的耐高滲酵母，為實現發酵法生產D-阿拉伯糖醇的技術路線奠定基礎。另外，作者將繼續研究產不同類別糖醇的耐高滲酵母在高滲環境下的生長能力的差異和積累某種多元醇的抗壓能力的相關度，從而進一步解釋酵母的耐高滲代謝機制。

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