腫瘤相關巨噬細胞模型建立的實驗研究

張國良， 劉鹥雯， 何怡青， 楊翠霞， 王文涓， 杜 艷， 高 鋒

(上海交通大學附屬第六人民醫院中心實驗室，上海200233)

惡性腫瘤發生時，外周血單核細胞浸潤至腫瘤間質，逐步被誘導分化為腫瘤相關巨噬細胞(tumor-associated macrophage，TAM)。近年研究發現TAM不具有殺傷腫瘤細胞的功能，反而能促進腫瘤生長和發展，其表型特征和功能與M2型巨噬細胞極為相似，是一種“促進腫瘤進展的 M2型巨噬細胞”［1］。TAM是腫瘤間質中的主要免疫細胞，臨床研究表明TAM數量與腫瘤患者的預后呈負相關［2］，利用基因或治療性方法清除腫瘤局部的TAM將會抑制腫瘤進展［3-4］。然而，目前缺少一種理想的TAM細胞模型來進行相關機制的研究。

在研究TAM與腫瘤細胞相互作用機制的體外試驗中，目前應用最多的是利用佛波酯(phorbol myristate acetate，PMA)、白細胞介素4(interleukin 4，IL-4)和白細胞介素13(interleukin 13，IL-13)誘導的THP-1細胞作為TAM模型。在本研究中，我們利用IL-4和IL-13刺激新鮮分離的人外周血單核細胞，通過檢測單核細胞表面的分子標志(CD14、CD204和CD206)、分泌的細胞因子及其殺傷功能的變化來確定其是否分化為TAM，以探索能模擬腫瘤微環境中TAM的細胞模型，便于展開相關研究。

材料和方法

一、試劑和儀器

人乳腺癌細胞株BT-549(中國科學院典型培養物保藏中心);RPMI1640培養液、胎牛血清(Gibco，美國);別藻藍蛋白(allophycocyanin，APC)-抗CD14抗體及同型對照抗體、白細胞介素10(interleukin 10，IL-10)酶聯免疫吸附試驗(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)檢測試劑盒 (eBioscience，美國)，藻紅蛋白(phycoerythrin，PE)-抗CD204抗體及同型對照抗體(R＆D，美國)，PE-抗 CD206抗體及同型對照抗體(Biolegend，美國);Hoechst 33342(碧云天，中國);流式細胞儀(Beckman Coulter，CA，美國);倒置熒光顯微鏡(Olympus IX70，日本)。

二、方法

1.分離人外周血單核細胞 取正常人體檢抗凝血，加入等體積磷酸鹽緩沖液(phosphate buffer saline，PBS)充分混勻，將稀釋的全血按2∶1比例緩慢沿試管壁鋪在淋巴細胞分離液上，室溫下1 500×g離心20 min，小心吸出中間的云霧層細胞至另一離心管中，用RPMI1640培養液500×g離心10 min洗滌2次。將洗滌后的細胞重懸于含10%胎牛血清以及100 U/mL青、鏈霉素的RPMI1640培養液中，調整細胞濃度為5×106/mL，臺盼蘭拒染試驗示活細胞＞95%。將細胞按以上濃度接種于培養瓶中，置37℃、5%CO2培養箱培養2～4 h后吸出培養基，用37℃預熱的培養液清洗3次，將未貼壁細胞洗脫。

2.單核細胞誘導分化 上述貼壁細胞經乙二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid，EDTA)消化后離心，棄上清后重懸，接種5×105個單核細胞于T25培養瓶中，對照組為正常培養，實驗組加入IL-4和IL-13刺激。IL-4和IL-13濃度均為20μg/mL［5］。確定 IL-4和 IL-13刺激時間的預實驗如下:用上述濃度的IL-4和IL-13分別刺激單核細胞，分別在3、4、5和6 d時用流式細胞術(flow cytometry，FCM)檢測其表面分子標志物的表達。結果顯示，單核細胞表面CD204和CD206的表達在IL-4和IL-13刺激5 d后明顯增加。因此，在正式實驗中我們用20 ng/mL的IL-4和IL-13刺激單核細胞5 d，誘導其分化。

3.FCM檢測單核細胞表面特異性抗原 實驗分為常規培養組和IL-4/IL-13誘導組。單核細胞經EDTA消化后離心，棄上清后用PBS洗滌2次，計數，2組細胞均按每管約106個細胞的數量，分別收集至2個EP管中，其中實驗管加入適量鼠抗人CD14單克隆抗體，對照管加入等體積CD14同型對照抗體，室溫避光溫育30 min，PBS洗滌2次，500μL PBS重懸，移至流式測試管中，上機檢測。應用同樣方法檢測單核細胞表面CD204和CD206的表達。

4.ELISA檢測單核細胞分泌的IL-10 將分離的單核細胞接種于24孔板(2×105/孔)，對照孔為正常培養孔，實驗孔加入IL-4和IL-13(均為20 ng/mL)，培養5 d后收集上清，離心去沉渣后凍存于－20℃冰箱。按上述方法收集3次單核細胞上清，每次均為3復孔，然后按照ELISA試劑盒說明書提供的步驟檢測上清中的IL-10含量。

5.BT-549細胞轉染紅色熒光蛋白(red fluorescent protein，RFP) 將處于對數生長期的BT-549細胞接種于6孔板(2×105/孔)，待24h細胞生長至40%～50%融合時準備轉染，棄去上清，于6孔板的每孔中加入含低濃度胎牛血清(＜10%)的RPMI1640培養基1mL，按感染復數(multiplicity，MOI)5、10、15、20 加入不同滴度的慢病毒顆粒(Lentivirus-RFP)，同時加入聚凝胺(終濃度5μg/mL)，充分搖勻后置37℃、5%CO2細胞培養箱中。作用8～12 h后用PBS洗滌細胞，加入10%胎牛血清的RPMI1640培養基繼續培養，24、48和72h后在熒光顯微鏡下觀察轉染細胞的紅色熒光和細胞毒性反應，以此確定大致轉染效率(最佳點時拍照)。利用嘌呤霉素篩選陽性細胞，每隔2～3天加1次抗菌藥物，連續篩選2～3次，之后繼續培養、傳代擴增，建立穩定的細胞株。

6.Hoechst染色檢測腫瘤細胞凋亡 將分離的單核細胞接種于24孔板(5×104/孔)，對照孔為正常培養孔，實驗孔加入IL-4和IL-13(均為20 ng/mL)，培養5 d后棄上清，EDTA消化后離心，棄上清后用RPMI1640培養液重懸，將其分別加入事先接種RFP-BT-549細胞的(2×104/孔，培養24h)24孔板中。2種細胞共培養24h后，PBS洗滌2次，4%多聚甲醛室溫固定10 min，PBS洗滌后加入適量Hoechst 33342染液，4℃避光溫育過夜。觀察之前PBS洗滌3次，熒光顯微鏡下細胞核濃縮、染色致密者即為處于凋亡狀態的腫瘤細胞，計數。

三、統計學方法

結 果

一、外周血單核細胞鑒定

分離人外周血單核細胞后，利用FCM檢測單核細胞表面特異標志物CD14的表達率，以確定其純度。結果顯示所分離單核細胞的CD14表達率為97.56%±1.85%。見圖1。

二、IL-4/IL-13誘導單核細胞表達TAM標志分子

正常培養組單核細胞表面CD204和CD206的表達率均較低，IL-4/IL-13(20 ng/mL)誘導組單核細胞表面CD204和CD206的表達率均顯著增高(P＜0.001)，CD14的表達率無明顯差異。見圖2。

圖1 人外周血單核細胞表面CD14表達

圖2 單核細胞表面CD14、CD204和CD206的表達

三、IL-4/IL-13促進單核細胞分泌IL-10

常規培養組單核細胞的IL-10分泌量較低［(6.19±3.12)ng/mL］，IL-4/IL-13(20 ng/mL)刺激組單核細胞的IL-10分泌量顯著增加［(18.63±10.20)ng/mL，P＜0.05］。見圖3。

四、TAM對腫瘤細胞的殺傷功能

常規培養的RFP-BT-549細胞未觀察到凋亡現象;RFP-BT-549細胞與正常單核細胞共培養后，出現大量的凋亡細胞;當RFP-BT-549細胞與IL-4/IL-13誘導后的單核細胞共培養時，RFPBT-549細胞的凋亡率顯著降低(P＜0.001)。見圖4。

圖3 ELISA檢測單核細胞IL-10的分泌量

圖4 Hoechst染色觀察腫瘤細胞凋亡

討 論

TAM在腫瘤的發生和發展過程中發揮重要作用，可表現在多個環節，其中包括分泌多種生長因子，促進腫瘤細胞的生長［6-7］;分泌多種蛋白酶，破壞腫瘤細胞周圍的基底膜，從而間接促進腫瘤細胞向周圍組織侵襲［8-9］;分泌大量促進血管生成的細胞因子和調節血管生成的酶類，并可表達血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)-C和 VEGF-D，從而促進腫瘤血管和淋巴管的生成［10-12］;與腫瘤化療耐藥性密切相關［13-14］。TAM已成為抗腫瘤治療的作用靶點，而TAM與腫瘤細胞相互作用機制也成為近年研究的熱點，但目前缺乏一種理想的TAM細胞模型。現有研究手段主要利用商品化的人外周血單核白血病細胞株THP-1作為巨噬細胞分化的模型，在PMA及IL-4/IL-13的作用下可分化為具有M2表型的巨噬細胞，以作為TAM模型。在體外實驗中，將該TAM模型與腫瘤細胞共培養，研究其相互作用及機制［15-16］。然而，THP-1細胞是一種幼稚的單核白血病細胞，處于低分化狀態，并不具備人外周血單核細胞所具有的各項免疫學功能。雖然THP-1細胞在PMA及IL-4/IL-13的誘導下可呈現M2型巨噬細胞的表型，但在功能方面并不能模擬單核細胞來源的TAM，因此用其作為TAM模型并不能真正模擬腫瘤微環境中的TAM。

在本研究中，我們分離健康人外周血單核細胞，并利用FCM檢測分離純度。利用IL-4/IL-13刺激純化的單核細胞后，發現其表面標志物CD204、CD206表達明顯增高，IL-10的分泌量也顯著升高。CD204是巨噬細胞清道夫受體1(macrophage scavenger receptor 1，MSR1)，CD206是巨噬細胞甘露糖受體(macrophage mannose receptor，MMR);IL-10是一種抑制炎性反應的細胞因子，可下調巨噬細胞表面主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex，MHC)Ⅱ以及協同刺激分子CD80和CD86的表達，使其抗原呈遞能力降低，并可抑制巨噬細胞分泌炎性細胞因子和化學因子，使其促炎癥能力降低［17］。通過經典途徑激活的巨噬細胞(M1型巨噬細胞)低表達CD204和CD206，其IL-10的分泌量也較低。而在腫瘤微環境中各種因素的作用下，TAM高表達 CD204和 CD206，并分泌較多的 IL-10［18-19］。本研究中，經IL-4/IL-13誘導的單核細胞高表達CD204和CD206，其IL-10分泌量也顯著增高，呈現出TAM的表型。

與表型改變相比，TAM的功能改變同樣重要。TAM呈現M2型巨噬細胞的功能，失去了對腫瘤的殺傷能力。本研究結果顯示，與對照細胞相比，IL-4/IL-13誘導的單核細胞對腫瘤細胞的殺傷能力顯著降低，從而證實其具有TAM的功能。據報道，人外周血單核細胞經巨噬細胞集落刺激因子誘導5～7 d后再經IL-4/IL-13誘導3 d可作為TAM模型［5］。本研究利用IL-4/IL-13誘導人外周血單核細胞5 d后也可使其呈現TAM的表型和功能，與現有方法相比，縮減了步驟和時間，可操作性更強，但還需進一步的實驗驗證該TAM模型的穩定性和實用性，以便未來廣泛的應用。

綜上所述，本研究已成功建立了TAM體外分化的細胞模型，與利用THP-1細胞建立的TAM模型相比，本研究利用人外周血單核細胞建立的TAM模型在表型及功能方面更能模擬腫瘤微環境中的TAM，可用于研究TAM與腫瘤細胞之間的相互作用及其機制。

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